Co łączy wirusologię i epigenetykę? Pozornie niewiele, o ile nie bierzemy pod uwagę „szóstej zasady DNA”. 5-hydroksymetylocytozna, bo o niej właśnie mowa, po raz pierwszy została dostrzeżona w genomie jednego z bakteriofagów w 1952 roku. Początkowo nie przywiązywano zbyt wielkiej wagi do tego odkrycia, jednak nabrało ono niebagatelnego znaczenia, gdy badacze wzięli pod lupę proces demetylacji DNA. Kluczowym etapem tego procesu okazała się hydroksylacja metylocytozyny, którą wcześniej postrzegano jako rzadki skutek stresu oksydacyjnego. Jednakże jeszcze większym zaskoczeniem był fakt, że usunięcie grupy metylowej nie zawsze powoduje „włączenie” genu – czasami efekt jest wręcz odwrotny.

Zacznijmy jednak od początku: metylacja DNA zachodzi w każdej żywej komórce, od momentu poczęcia aż od śmierci, i ma ona na celu (w dużym uogólnieniu) zahamowanie ekspresji konkretnych genów oraz ochronę genomu przed wirusami i transpozonami. Tę reakcję katalizuje grupa enzymów – metylotransferaz DNMT – przenoszących grupę –CH₃ z S-adenozylo-L-metioniny na 5. atom węgla w pierścieniu cytozyny. U człowieka występują 3 takie metylotransferazy: izoenzymy DNMT3a i DNMT3b, które odpowiadają za metylację de novo oraz DNMT1 gwarantująca zachowanie wzoru metylacyjnego podczas podziału komórki. Nasza wiedza na temat reakcji odwrotnej czyli demetylacji DNA jest zdecydowanie szczuplejsza, ponieważ jej molekularne podstawy poznajemy od zaledwie czterech lat.

Poziom ekspresji wielu białek ulega zwiększeniu lub zmniejszeniu w różnych fazach rozwoju organizmu, stąd też wniosek, iż stopień zmetylowania poszczególnych fragmentów genomu także ulega dynamicznym zmianom. Obecność metylocytozyny w obrębie promotorowym lub intronie skutecznie utrudnia dostęp czynnikom transkrypcyjnym i hamuje polimerazę RNA, przez transkrypcja nie może zachodzić – taki gen jest nieaktywny. Usunięcie grupy metylowej poprzez zerwanie silnego wiązania węgiel – węgiel wymaga dużego nakładu energii, dlatego też proces ten przebiega wieloetapowo.

Pierwszy a zarazem najważniejszy etap stanowi wspomniana już hydroksylacja metylocytozyny. Mechanizm tej reakcji pozostawał zagadką do 2009 roku, a na jej rozwiązanie wpadła grupa naukowców pod kierownictwem prof. Mamty Tahiliani’ego z Uniwersytetu w Nowym Yorku. Białka TET (Ten-Eleven Translocation) potrafią przekształcać 5-metylocytozynę (5mC) w 5-hydroksymetylocytozynę (5hmC), ponadto ich zawartość w komórce koreluje ze wzrostem poziomu 5hmC w stosunku do 5mC. Rodzina TET (TET1, TET2 i TET3) posiada w swej budowie centrum katalityczne z atomem żelaza Fe²⁺ , charakterystyczne dla dioksygenaz wykorzystujących kwas ketoglutarowy do utleniania substratów. Ponadto TET1 i TET3 zawierają domenę CXXC, która pozwala im na wiązanie się z DNA (co ciekawe ta domena występuje także w metylazach DNA DNMT).

Poziom 5hmC różni się znacznie w zależności od typu komórek i waha się 0,01 – do około 0,6% wszystkich nukleotydów. Zakłada się, że im bardziej zróżnicowana i ustabilizowana komórka, tym mniej hydroksymetylocytozny tym możemy się spodziewać. W dorosłym organizmie największą ilość 5hmC stwierdzono w mózgu (tu stwierdzono także, że demetylacja DNA ma wpływ na przebieg neurogenezy), nerkach, gruczołach piersiowych oraz w sercu. Tymczasem hydroksylacja 5mC najaktywniej przebiega w zygocie oraz w stadium zarodka. Wtedy też TET3 wymazuje wzory metylacji rodzicielskiej (z przedjądrza ojcowskiego – całkowicie, z przejądrza matczynego – niecałkowicie). Następnie TET1 i TET2 biorą udział w ukierunkowaniu embriogenezy, utrzymując właściwy poziom ekspresji genów house-keeping, sprzyjając zachowaniu właściwej liczby komórek macierzystych i hamując ich różnicowanie. W czasie tak intensywnych podziałów komórkowych, jakie zachodzą podczas rozwoju zarodkowego, hydroksymetylocytozyna zostaje przepisana jako niezmodyfikowana cytozyna (nie jest rozpoznana przez DNMT1) i dochodzi do pasywnej demetylacji DNA.

Pozostaje zatem pytanie, co ze zróżnicowanymi komórkami np. neuronami, które nie dzielą się tak często? Dla nich przeznaczona jest droga aktywnej demetylacji mogąca przebiegać na kilka rożnych sposobów. Pierwszy z nich to dalsze utlenianie przez białka TET - najpierw do 5-formylocytozyny (5fC), a następnie do 5-karboksycytozyny, która musi ulec dekarboksylacji, lecz mechanizm tej reakcji nie został do końca poznany. 5hmC może również ulec glikozylacji dzięki TDG (thymine-DNA glycosylase) lub deaminacji przez AID (activation-induced deaminase) do hydroksymetylouracylu. W obydwu wypadkach zmodyfikowany nukleotyd zostaje uznany przez system naprawy DNA (BER) za „nieprawidłowy” i zastąpiony cytozyną. W ten sposób demetylowane są  rejony wysp CpG znajdujące się przeważnie blisko miejsca inicjacji transkrypcji, do których TET1-3 najchętniej się przyłączają i zapobiegają ich powtórnej metylacji.

Białka TET nie zawsze umożliwiają zwiększenie ekspresji, mogą ją także hamować. Udowodniono, że przyłączenie się TET  w okolicy promotorów niektórych genów ułatwia rekrutację represorów transkrypcji np. PRC2 czy kompleksu Sin3A. Geny te są zazwyczaj związane z dyferencjacją, co dodatkowo potwierdza to tezę, iż białka TET zapobiegają różnicowaniu się komórek.

Biorąc pod uwagę fakt, iż pod kontrolą demetylacji zależnej od TET znajduje się ponad 1000 genów, w tym także te odpowiedzialne za prawidłowy rozwój i różnicowanie, zaburzenie tak ważnego procesu może prowadzić do niemałej katastrofy. Zespół Retta, uwarunkowa genetycznie odmiana autyzmu o ciężkim przebiegu, jest związana z mutacją genu MeCP2. Gen ten koduje czynnik transkrypcyjny chroniący zmetylowane DNA przed białkami TET, a w przypadku jego niedoboru wzrasta poziom 5hmC, co z kolei prowadzi do nieprawidłowej neurogenezy i zaburzeń neurologicznych. Mutacje genów TET również niosą ze sobą poważne konsekwencje: zmiany w obrębie genu TET2 to jedna z najczęstszych nieprawidłowości stwierdzanych w nowotworach szpiku (nawet 50% przypadków): zespoły mielodysplastyczne (MDS), przewlekła białaczka mielomonocytowa (CMML), ostra białaczka szpikowa (ALL) i wiele innych.

Poznawanie demetylacji DNA to dopiero początek. Pozostało wiele pytań bez odpowiedzi: W jaki sposób TET są rekrutowane we właściwe miejsce? Czy 5hmC posiada funkcje sygnałowe? Dlaczego utrata funkcji przez TET sprzyja rozwojowi nowotworów? I w końcu: czy to na pewno TET gra pierwsze skrzypce w tym procesie? Te i jeszcze wiele innych zagadek musi zostać rozwikłanych, abyśmy mogli uznać  naszą wiedzę za w pełni satysfakcjonującą.

Anna Kołodziejczak