Zjawisko Förster’a i białko GFP

Liczne badania naukowe dowiodły, że zielone białko fluoryzujące, współwystępującez akworyną ulega wzbudzeniu i z nią oddziałuje na zasadzie zjawiska FRET (ang. Fluorescence Resonance Energy Transfer). Maksimum emisji akworyny przypada dla 470 nm, zaś jedno z maksimów absorpcji zielonego białka fluoryzującegowystępuje przy 480 nm. Dzięki temu energia emitowana przez wzbudzonąakworynę (donora) jest przekazywana do GFP (akceptora), które z kolei oddaje energie na sposób promienisty, fluoryzując na zielono. Wydajność kwantowa tego zjawiska jest stosunkowo wysoka: 0,72.

Budowa GFP

Białko zielonej fluorescencji jest białkiem o masie 27kDa, złożonym z 238 aminokwasów. Forma natywna GFP tworzy baryłkę zbudowaną z 11 odcinków o drugorzędowej strukturze β-kartki. Wewnątrz baryłki znajduje się odcinek α-helikalny, tworzący rusztowanie dla chromoforu. Układem bezpośrednio odpowiedzialnym za fluorescencję w białku GFP jest trójka kolejnych aminokwasów Ser65, Tyr66, Gly67, która w czasie około dwóch godzin po syntezie białka tworzyspecyficzny chromofor p-hydroksybenzylidenoimidazolinon. Ugrupowanie chromoforu jest szczelnie chronione wewnątrz proteiny, tym samym w bezpośrednim otoczeniu chromoforu znajduje się wiele reszt aminokwasowych, które w pierwszorzędowej strukturze białka są od siebie znacznie oddalone. Proksymalna obecność aminokwasów ma diametralny wpływ na proces absorpcji i emisji kwantów światła. Widmo absorpcji białka GFP posiada dwa szczyty: jeden przy długości 397nm odpowiadający uprotonowanej cząsteczce Tyr66, drugi 475nm odpowiadający nieuprotonowanej cząsteczce Tyr66. Widmo emisji ma jeden szczyt dla długości fali 508nm. Formowanie się chromofora jest procesem autokatalitycznym więcGFP nie wymaga kofaktorów oraz pomocy innych białek aby utworzyć strukturę natywną. Istnieje jednak zależność wydajności fluorescencji (pojmowanej jako wskaźnik ilości poprawnie sfałdowanych białek) od temperatury. Wydajność spada w temperaturach powyżej 30˚C.

Dlaczego GFP jest tak popularne?

GFP może być syntetyzowane w komórkach organizmu będącego celem badania. Należy poprzedzić gen na GFP promotorem odpowiednim dla gatunku biorcy, tak aby mogło dojść do transkrypcji. Gen może zostać odziedziczony przez komórki/organizmy potomne, co czyni z białka GFP marker dziedziczenia. Ponadto, dołączenie genu na GFP do genu kodującego inne białko, na końcu 3’ lub 5’, w ogromnej większości przypadków nie wpływa negatywnie na przyjęcie natywnej formy przez oba białka i prowadzi do utworzenia przez te białka hybrydy. Jednocześnie jeżeli gen na GFP zostanie umieszczony pomiędzy sekwencją sygnałową, a genem na badane białko, to powstała po translacji hybryda trafi dzięki peptydowi sygnałowemu do miejsca docelowego w komórce. Na podstawie przeprowadzonychanaliz fizycznych i chemicznych można stwierdzić, że białko wykazuje dużą trwałość. Ulega degradacji w 6M chlorku guanidyny w temperaturze 90˚C oraz w pH mniejszym od 4 i większym od 12. Podczas denaturacji w wyżej wymienionych warunkach ulega zaburzeniu struktura β-kartki. Posiada ono jednak zdolność do renaturacji w przeciągu kilku minut. Odwracalny (przy dostępie tlenu) zanik fluorescencji obserwowany jest po działaniu na białko redukującym ditionianem sodu, nieodwracalny po działaniu 2-merkaptoetanolem w obecności DTNB. Znajduje się coraz więcej jego analogów u innych jamochłonów, takich jak Renilla czy Obelia.

Zalety GFP, jako narzędzia w biologii molekularnej

Obserwuje się niską cytotoksyczność białka GFP, co umożliwia szerokie stosowanie w żywych organizmach. Wysoka stabilność natywnej formy białka jest gwarantem minimalizacji błędów pomiarowych wynikających z destrukcji barwnika. W odróżnieniu od innych białek wykazujących fluorescencję, GFP nie wymaga kofaktorów (jak akworyna), ani towarzyszących białek i ATP (jak lucyferaza). Do jego wzbudzenia fluorescencji wymagane jest jedynie światło mieszczące się w zakresie absorbancji. Jednakże białko GFP ulega różnym modyfikacjom dlaczego? Otóż używając formy dzikiej GFP nie jest się w stanie prowadzić obserwacji przez pierwsze 2 h po translacji. GFP, pochodzący od organizmu morskiego posiada optimum szybkości fałdowania w temperaturze około 20˚C. Widmo emisji charakterystyczne dla typu dzikiego może pokrywać się z widmem struktur komórkowych wykazujących autofluorescencję lub innych barwników, jak np. fluoresceina. Z kolei widmo wzbudzenia białka typu dzikiego jest szerokie i ma dwie wartości maksymalne. Ich molowy współczynnik absorbancji jest zależny od pH. Oznacza to, że pomiary mogą ograniczać możliwość selektywnego wzbudzenia, oraz że obserwowana fluorescencja może zależeć od niekontrolowanych przez badacza zmian środowiska wewnętrznego układu. Niestety przy wysokich stężeniach GFP może agregować, co ma wpływ na spektrum fali wzbudzenia. Aby zaobserwować świecenie GFP, konieczna jest dostępność tlenu, ponieważ w warunkach beztlenowych nie dochodzi do prawidłowego formowania się odpowiedzialnego za świecenie fluoroforu i pojawienia się sygnału świetlnego.

Inne świecące białka…

Sergey Lukyanov odkrył i wyizolował pierwsze białko wykazujące fluorescencję z koralowca Discosoma striata, znane powszechnie jako DsRed. Chromofor jest bardzo podobny do tego występującego w GFP, ale przez inną ilość wiązań podwójnych, wykazuje inne właściwości spektralne. Wadą białka DsRed jest to, że podczas powstawania fluorescencji białko przejściowo świeci w zielonym zakresie widma - tzw. „zielony stan”. Warianty białka znane pod nazwą DsRed2 są zbiorem mutantów o większej użyteczności wynikającej z redukcji toksyczności i zmniejszeniu tendencji do tworzenia agregatów. Trzecia generacja DsRed zawiera ponadto mutacje zwiększające wydajność fluorescencji i zmniejszające czas tworzenia fluoroforu. Niewątpliwą ich zaletą jako markerów komórkowych jest widmo emisji bliskie czerwieni.

Wykorzystanie białek fluorescencyjnych w biologii i metodach chemii fizycznej:

- znakowanie struktur komórkowych, organelli i białek. Białka jako markery dają możliwość obserwacji struktur mniejszych niż rozdzielczość mikroskopowa lub nie różniących się od otoczenia gęstością optyczną.

- poprzez dodatek fluoryzującej etykiety możliwa jest lokalizacja białek w komórce.

- obserwacja przemian komórkowych jak choćby podziały - przy użyciu dwóch fluoroforów połączonych z różnymi białkami można mierzyć odległość między nimi lub szybkość ich przemieszczania w cytoplazmie bądź błonie komórkowej przy użyciu techniki FRET. Można używać tej metody jako linijki o skali kilku nanometrów.

- FRAP (ang. Fluorescence Recovery After Fotobleaching). Jest to metoda wykorzystująca efekt fotobleachingu możliwa do zrealizowania przy użyciu mikroskopii konfokalnej. Po naświetleniu fragmentu komórki lub struktury komórkowej przy użyciu zwiększonej mocy lasera i tym samym wywołaniu fotoblaknięcia, można obserwować czy dochodzi do migracji nieuszkodzonego fluoroforu na zaciemnione miejsce. Mierzy się w ten sposób ruchliwość białek w obrębie danego fragmentu komórki.

- eksperymenty FCS (ang. Fluorescence Correlation Spectroscopy), pozwala na zebranie informacji o kinetyce białek. Dyfundujące wyznakowane białka mierzone są w małej objętości (około 1 femtolitr) w skali czasu. Możliwe jest uzyskanie informacji o współczynniku dyfuzji, stałych dysocjacji i stężeniu.

- możliwe jest zastosowanie białek fluorescencyjnychw skali całego organizmu. Przykładem może być wybarwienie DsRed komórek rakowych, a komórek nabłonka naczyń krwionośnych EGFP. W ten sposób możliwe jest śledzenie angiogenezy równolegle z rozwojem nowotworu.

- obserwacja komórek nerwowych

- GFP jako fluorescencyjne narzędzie w analizie ekspresji genów i konstrukcji biosensorów

Materiał został przygotowany przez dr Marzenę Szwed, Redaktora naukowego portalu biotechnologia.pl