Biotechnologia.pl
łączymy wszystkie strony biobiznesu
Spinach aptamer czyli fluorescencyjne RNA
Odkrycie zielonego białka fluorescencyjnego (GFP) nie tylko zrewolucjonizowało dziedzinę biologii molekularnej ale także stało się inspiracją do projektowania podobnych systemów emitujących światło do zastosowań w sensoryce. Spinach aptamer, podobnie jak zielone białko fluorescencyjne, umożliwia monitoring ekspresji genów (na poziomie transkrypcji), jak również może stanowić element biosensora do detekcji innych metabolitów.

Spinach aptamer to jednoniciowa cząsteczka RNA, które po związaniu odpowiedniego ligandu emituje zielone światło fluorescencyjne. Chemiczna struktura ligandu odpowiedzialnego za nietypowe właściwości aptameru została zainspirowana strukturą fluoroforu tworzonego w GFP przez 3 sąsiadujące aminokwasy. Białko GFP ma zdolność emisji promieniowania, ponieważ w odpowiednich warunkach trzy ze składających się na nie aminokwasów (seryna, tyrozyna i glicyna) ulegają cyklizacji, co prowadzi do powstania związku o sprzężonym układzie wiązań podwójnych (HBI). Grupa naukowców pod kierownictwem Samiego R. Jaffrey’a, używając szkieletu chromoforu HBI, zaprojektowała związek chemiczny zwany DMHBI (3,5-difluoro-4-hydroxybenzylidene), a następnie przy pomocy ewolucji in vitro (SELEX) wyselekcjonowała cząsteczkę RNA wykazującą wysokie powinowactwo do ligandu (DMHBI) i zmieniającą jego właściwości optyczne.

 

Oddziaływanie pomiędzy związkiem chemicznym a kwasem nukleinowym zdeterminowane jest odpowiednią sekwencją i strukturą przestrzenną przybieraną przez RNA. Zarówno sama molekuła RNA jak i wolny DMHBI nie wykazują fluorescencji. Dopiero stworzony przez nie kompleks przejawia interesujące właściwości optyczne. Prawdopodobnie dzieje się to za sprawą zmiany konformacji cząsteczki DMHBI z ruchomej (niezwiązana) na sztywną (związana z RNA).

Struktura fluoroforu zielonego białka fluorescencyjnego (HBI) i ligandu dla aptameru Spinach (DMHBI). [DOI: 10.1126/science.1207339]

 

Aptamer Spinach to kolejna, obok białek fluorescencyjnch, cząsteczka o ogromnym potencjale do zastosowań w biologii molekularnej. Jeżeli sekwencję aptameru zintegrujemy z sekwencją genu, który nas interesuje, uzyskujemy możliwość kontroli ekspresji genów na poziomie transkrypcji, jak również monitorowania w jakim miejscu i czasie dany gen staje się aktywy.

Oprócz zastosowań w biologii molekularnej nieoceniona jest również rola Spinach aptameru w rozwoju technologii diagnostycznch. Sekwencja „szpinakowego RNA” coraz częściej używana jest do projektowania biosensorów działających zarówno in vitro jak i in vivo. Przykładem mogą być sensory do wykrywania wewnątrzkomórkowych metabolitów, takich jak adenozyna, adenozyno-difosforan (ADP),
S-adenozylometionina (SAM), guanozyna czy trifosforan guanozyny (GTP).

Zasada działania takiego sensora jest dosyć prosta – składa się on z dwóch połączonych ze sobą aptamerów, z czego jeden to Spinach, a drugi to aptamer rozpoznający określony metabolit (np. ADP). Aptamery te połączone są ze sobą za pomocą odpowiedniej sekwencji RNA, zwanej przetwornikiem (ang. transducer), która umożliwia komunikację pomiędzy dwiema jednostkami. Bioczujnik zaprojektowany jest w taki sposób, że dopiero związanie konkretnego metabolitu powoduje zmiany strukturalne w części komunikacyjnej (przetworniku), co umożliwia przybranie aptamerowi szpinakowemu aktywnej konformacji i związanie ligandu DMHBI. Innymi słowy, pod nieobecność badanego metabolitu motyw Spinach jest w konformacji nieaktywnej, stąd brak możliwości związania ligandu (DMHBI) i brak sygnału.

 

Schemat działania bioczujnika opartego o Spinach aptamer.
[DOI:10.1126/science.1218298]

 

Jaki kierunek obiorą badania z wykorzystaniem fluorescencji kwasów nukleinowych? Samie R. Jaffrey, główny autor badań dotyczących aptameru Spinach, pracuje w chwili obecnej nad wynalezieniem podobnych systemów RNA, które emitowałyby światło w barwach innych niż zielona. W serii wykładów, które wygłosił podczas swojej podróży po Europie, wspominał o aptamerach Carrot i Radish. Co więcej, w artykule opublikowanym na początku tego roku w Journal of American Chemical Society, jego zespół badawczy donosi, że możliwym jest modyfikowanie właściwości optycznych aptameru bez zmieniania sekwencji RNA, a jedynie przekształcając podstawniki w cząsteczce ligandu. W ten sposób udało się stworzyć system, który w zależności od użytego fluoroforu będzie wykazywał różne właściwości optyczne. Naukowcy nazwali tę strategię technologią Plug-and-Play. Technologia ta, wraz z zestawem białek fluorescencyjnych, znacznie poszerza gamę możliwości dotyczących obrazowania procesów zachodzących w komórkach.

Zmiana długości fali światła emitowanego przez kompleks RNA-ligand przy pomocy technologii Plug-and-Play. [DOI: 10.1021/ja410819x]

 

Źródła

Źródła:

  1. RNA Mimics of Green Fluorescent Protein, Science 2011, 333, 642-646
  2. Fluorescence Imaging of Cellular Metabolites with RNA, Science 2012, 335, 1194
  3. Imaging bacterial protein expression using genetically encoded RNA sensors, Nature Methods, 10, 873-875
  4. Plug-and-Play Fluorophores Extend the Spectral Properties of Spinach, Journal of American Chemical Society, 2014, 136, 1198-1201
KOMENTARZE
Newsletter