Według Klaenhammera (1) 99% bakterii posiada zdolność do wytwarzania co najmniej jednej bakteriocyny. Zdolność tę zaobserwowano najpierw u bakterii Gram-ujemnych, a dopiero później u bakterii Gram-dodatnich (1). Bakteriocyny to peptydy lub białka o zróżnicowanych właściwościach biochemicznych, masie cząsteczkowej, mechanizmie działania, spektrum aktywności oraz lokalizacji i sekwencji genu (2). Posiadają aktywność antydrobnoustrojową skierowaną przeciwko tym samym szczepom bakterii, w których są produkowane, bądź też przeciwko szczepom z blisko spokrewnionych gatunków. Bakteriocyny syntezowane są rybosomalnie, wydzielane na zewnątrz komórki i produkowane przez bakterie w celu wyeliminowania lub zahamowania rozwoju innych bakterii. W 1925 roku zostało udokumentowane pierwsze odkrycie wskazujące na to że bakterie produkują cząsteczki antydrobnoustrojowe. Wtedy to belgijski mikrobiolog Andre Gratia, badając Escherichia coli zauważył obecność substancji o wysokiej specyficzności antybiotycznej, której aktywność skierowana była przeciwko innym osobnikom ze szczepu tego samego gatunku (3). Aktywność antybiotyczna została następnie znaleziona także w innych gatunkach Enterobacteriaceae. Zaproponowano także nazwę dla tych substancji, pochodzącą od nazwy pierwszego organizmu z którego je wyizolowano, czy E. coli, a mianowicie kolicyny. Ogólnie nomenklatura bakteriocyn zazwyczaj bazuje na nazwach organizmów, które je produkują, np. monocyna z Listeria monocytogenes. W 1952 roku Jacob zaproponował wspólną nazwę dla białkowych substancji o wysokiej specyficzności antybakteryjnej skierowanej głównie przeciwko przedstawicielom tego samego szczepu, co producenci – bakteriocyny (4). Ta nazwa obowiązuje do dziś.
Badania na poziomie molekularnym wykazały, że synteza bakteriocyn zachodzi pod kontrolą genów zlokalizowanych w DNA plazmidowym lub chromosomalnym (5). Mikroorganizmy posiadają jednocześnie geny determinujące odporność na bakteriocyny produkowane przez producenta. Tym samym geny kodujące aktywne białko oraz kodujące odporność na nie są wspólnie ekspresjonowane. Poza tym ekspresjonowane są również geny odpowiedzialne za transport bakteriocyny z komórki, czasami również enzymy uczestniczące w potranslacyjnej modyfikacji bakteriocyn.
Największą i najlepiej do tej pory poznaną grupą bakteriocyn są bakteriocyny produkowane przez bakterie fermentacji mlekowej. Sztandarowym przedstawicielem tej grupy jest nizyna pochodząca z Lactoccocus lactis.
Efektem olbrzymiej różnorodności bakteryjnych populacji występujących wspólnie na danym obszarze jest specyficzna konkurencja zachodząca między tymi populacjami. W porównaniu z innymi organizmami żywymi zjawiska te charakteryzują się znacznie większą intensywnością. W szczególności nieprzeciętne zróżnicowanie komórek bakteryjnych i ich właściwości, szybki wzrost, pozwoliły na zamieszkanie i skolonizowanie różnorodnych środowisk przez różne gatunki i szczepy. W określonych warunkach środowiskowych, w których niektóre bakterie wykazują możliwość syntezy składników, takich jak bakteriocyny czy antybiotyki, których to obecność jest w stanie hamować rozwój konkurentów, stawia populację producenta na wyższym poziomie rozwojowym. Choć większa część bakterii zamieszkująca wszelkie środowiska wykazuje bakteriocynogenność (6), dokładna rola bakteriocyn w różnych populacjach nie została jeszcze poznana. Jasne jest iż, bakteriocyny stanowią podstawowy arsenał wykorzystywany przez bakterie konkurujące ze sobą. Zarówno badania in vivo,jak i in vitro wykazały, że większość szczepów w modelowych populacjach była producentami bakteriocyn (7). Bakteriocyny odgrywają także dużą rolę w ustalaniu terytorium zajmowanego przez konkretną kolonię bakterii (7). Przykładem mogą tu być bakterie Myxococcus. Przedstawiciele tego rodzaju zazwyczaj wchodzą w interakcje socjalne ze sobą nawzajem. Jednakże, bardzo ciężko jest znaleźć dwa gatunki Myxococcus, zajmujące to samo terytorium. Jeżeli dwa gatunki Myxococcus, np. M. xanthus orazM. virescens, zostaną razem zaszczepione na pożywkę agarową, to odseparują się od siebie, i stworzą własne monospecyficzne terytoria (8). Powodem takiego niecodziennego fenomenu są bakteriocyny. Co więcej w pożywkach płynnych tych dwóch gatunków przeważać będzie M. virescens. To także jest pośrednio związane z produkcją bakteriocyn i prawdopodobnie wyjaśnia powszechne liczniejsze występowanie M. virescens w przyrodzie.
Bakteriocyny są często mylnie porównywane z antybiotykami. Główną cechą różniącą te dwa typy substancji jest ich biosynteza. Kolejną ważną cechą odróżniającą antybiotyki i bakteriocyny jest ich spektrum działania, które jednocześnie limituje używanie zarówno bakteriocyn, jak i antybiotyków w przemyśle, bądź w medycynie. Antybiotyki nie mogą być używane na przykład jako dodatek do żywności, gdyż z racji swego szerokiego spektrum aktywności, oprócz szczepów patogennych, mogą likwidować także szczepy naturalnie występujące w danych produktach. Bakteriocyny zaś, z powodzeniem mogą zostać użyte jako dodatek do żywności kontrolujący i regulujący, wzrost i rozwój patogenów w jedzeniu. Tabela 1 ukazuje główne różnice pomiędzy antybiotykami a bakteriocynami.
Pomimo iż, dokładny stopień wzajemnych powiązań i interakcji, kompleksowość tych oddziaływań na poziomie ekologicznym i ewolucyjnym, nie są do końca jasne, można śmiało stwierdzić, iż bakteriocyny odgrywają fundamentalną rolę w dynamice rozwoju bakteryjnych populacji.
Klasyfikacja bakteriocyn
Klasyfikacja i nomenklatura bakteriocyn zmieniała się bardzo szybko i często w XX wieku. Początkowo bakteriocyny zdefiniowane były jako bakteryjne peptydy i białka, których wydzielenie powodowało śmierć komórki producenta, posiadające precyzyjny zakres aktywności i wiążące się do specyficznych receptorów komórkowych. Z czasem, odkryto związek syntezy bakteriocyn z obecnością plazmidów w komórkach. Fakt ten stał się kolejną cechą opisującą te związki. W roku 1957 Frederiq, bazując na wówczas najlepiej znanych kolicynach, ułożył klasyfikację która brała pod uwagę specyficzność adsorpcji do docelowych komórek, oraz specyfikę wykazywanej odporności (10). Podział ten nie był doskonały gdyż ciągle poznawano nowe detale w biologii bakteriocyn pozwalające precyzyjniej ustalać nowe grupy i podgrupy. W 1965 roku Reeves przedstawił listę szesnastu klas bakteriocyn bazującą na nazwach gatunków które je produkowały (11). Tak więc kolicyny były bakteriocynami pochodzącymi od E. coli, pestycyna z Yersinia pestis, monocyna z Listeria monocytogenes itp. Dwa lata później Bradley, jako kryterium klasyfikacji przyjął różnice strukturalne cząsteczek bakteriocynowych (12). Podzielił on bakteriocyny na dwie duże grupy, różniące się przede wszystkim masą cząsteczkową. W pierwszej grupie znajdowały się cząsteczki o niskiej masie cząsteczkowej, zazwyczaj termostabilne, nie tworzące osadu się podczas ultrawirowania, oraz nie dające się dobrze zanalizować pod mikroskopem elektronowym. Druga grupa obejmowała większe cząsteczki, łatwo sedymentujące, termolabilne, odporne na działanie trypsyny, i nadające się do analizy mikroskopem elektronowym. Jednak taka klasyfikacja, oparta tylko na różnicach morfologicznych, mogła prowadzić do pomyłek. Bakterie bowiem, mogą syntezować różne białka podobne pod względem budowy i uorganizowania do bakteriocyn, które w rzeczywistości bakteriocynami nie są. Z czasem gdy odkryto szereg bakteriocyn produkowanych przez bakterie Gram-dodatnie, zaistniała potrzeba sprecyzowania samej definicji bakteriocyn i stworzenia klasyfikacji biorącej pod uwagę różne właściwości tych związków. Pojawiły się bowiem nowe odkrycia dowodzące np., iż bakteriocyny bakterii Gram-dodatnich w większości nie posiadają specyficznego receptora, koniecznego do związania się z błoną komórki wrażliwej, który to powszechnie występuje w kolicynach. Bakterie Gram-dodatnie charakteryzuje również dużo większe spektrum aktywności niż w przypadku bakteriocyn z bakterii Gram-ujemnych. Transport wewnątrzkomórkowy i sposób wydzielania także są odmienny. Ponadto brak zewnętrznej błony komórkowej i różne poziomy odporności na własne bakteriocyny wykazały, iż bakteriocyny produkowane przez bakterie Gram-dodatnie należy klasyfikować odrębnie(13, 14). Wśród artykułów przeglądowych można spotkać się z bardzo ogólnym podziałem bakteriocyn na kolicyny, czyli bakteriocyny bakterii Gram-ujemnych, oraz bakteriocyny bakterii Gram-dodatnich. Ostatecznie szczegółowa klasyfikacja jest dużo bardziej skomplikowana i porusza kilka aspektów ułatwiających skategoryzowanie bakteriocyn w poszczególne grupy. Klasyfikacja bakteriocyn opiera się na zróżnicowaniu struktury chemicznej, masy cząsteczkowej, wrażliwości na działanie enzymów, obecności modyfikowanych aminokwasów oraz mechanizmie działania.
Bakteriocyny bakterii Gram-dodatnich
Najpopularniejszym, najczęściej spotykanym i używanym podziałem bakteriocyn Gram-dodatnich jest podział zaproponowany przez Klaenhammera w 1993 roku (1). Wśród bakteriocyn bakterii Gram-dodatnich uwzględnia on cztery główne klasy, wewnątrz których tworzą się podklasy (tabela 2).
Większość bakteriocyn produkowanych przez bakterie Gram-dodatnie jest kationowymi białkami, o charakterze hydrofobowym lub amfipatycznym. W podziale Klaenhammera pierwszą grupę stanowią tzw. lantybiotyki. Lantybiotyki są niewielkimi peptydami (< 5 kDa) a swoją nazwę zawdzięczają obecności rzadko spotykanego aminokwasu – lantioniny. W ich skład wchodzą także inne rzadkie aminokwasy jak, α – metylolantionina (MeLan), dehydroalanina, czy kwas dehydroaminomasłowy. Analizując różnice w strukturze chemicznej oraz aktywności, lantybiotyki podzielić można na dwie klasy (15). Typ A lantybiotyków obejmuje fibrylarne peptydy, dodatnio naładowane, których aktywność przejawia się poprzez tworzenie porów w błonie cytoplazmatycznej docelowych bakterii. Do typu B zalicza się globularne peptydy, o ładunku ujemnym, bądź w ogóle nie posiadające ładunku, których aktywność antybiotyczna polega na inhibicji specyficznych enzymów. Wszystkie lantybiotyki typu B produkowane są przez bakterie Gram-dodatnie, których DNA charakteryzuje się wysokim udziałem par G+C. Nie stwierdzono aby lantybiotyki typu B produkowane były przez bakterie fermentacji mlekowej LAB (Lactic acid bacteria) (16).
Do kolejnej klasy, największej w całej klasyfikacji, należą bakteriocyny nielantybiotykowe. Ogólnie, są to niewielkie termostabilne peptydy (< 10 kDa), nieposiadające charakterystycznej dla pierwszej klasy bakteriocyn lantioniny. Zazwyczaj mają charakter kationowy lub amfifilowy, niszczą komórki docelowych organizmów głównie poprzez permeabilizację błony komórkowej. Zakres aktywności obejmuje bakterie Gram-dodatnie o niskiej zawartości par G+C takie jak bakterie LAB, czy bakterie należące do rodzajów Listeria, Enterococcus i Clostridium. Z racji ich różnorodności podzielone zostały na cztery podklasy:
Trzecia klasa bakteriocyn obejmuje cząsteczki, o dużej masie cząsteczkowej, łatwo ulegające degradacji i inaktywacji pod wpływem wysokiej temperatury. Ich aktywność antybiotykowa wyraża się inaczej niż w innych klasach bakteriocyn, bowiem nie działają na komórki wrażliwe poprzez uszkodzenie ich błony komórkowej. Nie zostały jeszcze do końca poznane i dokładniej scharakteryzowane, dlatego stanowią przedmiot intensywnych badań.
Do ostatniej klasy bakteriocyn bakterii Gram-dodatnich zalicza się bakteriocyny, które do pełni swojej aktywności wymagają obecności reszty lipidowej bądź węglowodanowej. Przykładem są glikoproteiny: leukocyna S i laktocyna 27. Podobnie jak w przypadku bakteriocyn przynależnych do klasy trzeciej, bakteriocyny klasy czwartej też nie zostały dobrze poznane, zwłaszcza na poziomie biochemicznym.
.jpg)
Bakteriocyny bakterii Gram-ujemnych
Podział bakteriocyn bakterii Gram-ujemnych jest mniej obszerny (tabela 3). Charakterystyczne dla bakteriocyn bakterii Gram-ujemnych jest to, iż ich spektrum działania jest dużo węższe niż w przypadku lantybiotyków, czy bakteriocyn nielantybiotykowych. W wielu przypadkach zarówno producent, jak i szczepy wrażliwe należą do tej samej rodziny, a przede wszystkim do tego samego gatunku(18).
Największą grupę stanowią kolicyny. Syntezowane są przez ponad połowę szczepów E. coli, a także przez bakterie z rodzaju Shigella, oraz Serratia. Inne rodziny Enterobacteriaceae także produkują bakteriocyny, takie jak pestycyny – bakteriocyny wytwarzane przez Yersinia pestis, czy marcescyny – bakteriocyny syntetyzowane przez Serratia marcescens.
Kolicyny są dużymi białkami o masie cząsteczkowej wahającej się od 25 kDa do 80 kDa. Ich spektrum aktywności jest dość wąskie, i zazwyczaj wykazywane jest wobec bakterii przynależnych do blisko spokrewnionych szczepów (19). Docelowe bakterie, na które działają kolicyny zawierają na powierzchni komórek specyficzny receptor kolicynowy, do którego kolicyny się wiążą. W porównaniu z bakteriocynami bakterii gramdodatnich, kolicyny wykazują również wiele różnic, jeśli chodzi o uorganizowanie klastrów genowych i operonów odpowiedzialnych za ich syntezę. Sposób regulacji ich biosyntezy jest również odmienny. Bakteriobójcze działanie kolicyn polega na tym, iż formują one w błonie cytoplazmatycznej wrażliwych komórek kanały jonowe. Proces ten powoduje depolaryzację błony. Czasem kolicynowa aktywność antydrobnoustrojowa wyraża się poprzez degradację, bądź hamowanie syntezy peptydoglikanu w ścianie komórkowej docelowych bakterii (18). Warto zaznaczyć, iż synteza i eksport kolicyn są zabójcze dla komórki producenta i powodują jej lizę.
Kolejną odrębną klasę bakteriocyn syntezowanych przez bakterie Gram-ujemne stanowią mikrocyny. Są one niskocząsteczkowymi peptydami, których aktywność skierowana jest głównie przeciw osobnikom z blisko spokrewnionych szczepów. Mikrocyny syntezowane są przez bakterie z rodziny Enterobacteriaceae, a wszystkie poznane dotychczas syntetyzujące mikrocyny gatunki, z wyjątkiem Klebsiella pneumoniae, należą do gatunku E. coli (20). Mikrocyny różnią się między sobą mechanizmami działania, strukturą i genetyką. Ze względu na te różnice podzielone zostały na dwie klasy. Pierwsza klasa obejmuje niewielkie (< 5 kDa) peptydy, które ulęgają modyfikacjom potranslacyjnym i atakują głównie struktury wewnątrzkomórkowe. Druga klasa to nieco większe peptydy (7-10 kDa), które nie ulęgają modyfikacjom potranslacyjnym, zaś ich aktywność antybiotyczna wyraża się poprzez uszkadzanie i niszczenie błony komórkowej docelowych komórek. W przeciwieństwie do kolicyn, synteza mikrocyn nie jest letalna dla producenta. Związki te wykazują pewne cechy wspólne z niskocząsteczkowymi bakteriocynami syntetyzowanymi przez bakterie Gram-dodatnie, takie jak termostabilność, hydrofobowość i odporność na ekstremalne warunki.
Nizyna
Obecnie najlepiej znaną i najdokładniej zbadaną bakteriocyną jest nizyna. Jest najbardziej reprezentatywnym przedstawicielem lantybiotyków o rozpowszechnionym zastosowaniu. Mechanizmy działania, genetyka, biosynteza, i wszystko, co dotyczy biologii bakteriocyn było badane na nizynie. Historia nizyny sięga dwudziestolecia międzywojennego, kiedy to w 1928 po raz pierwszy zauważono inhibujący wpływ szczepów Streptococcus lactis na szczepy Lactobacillus bulgaricus. Sama nazwa „nizyna” (ang. nisin) zaproponowana została w 1947 roku przez Matticka i Hirscha (17). Już cztery lata później odkryte zostały potencjalne możliwości użycia nizyny jako naturalnego biokonserwantu w żywności, chroniącego jedzenie przed psuciem i namnażaniem się w nim bakterii. Nizyna jest peptydem zbudowanym z 34 reszt aminokwasowych. Z racji, że jest reprezentantem klasy lantybiotyków charakterystyczne jest dla niej występowanie w strukturze rzadkich aminokwasów takich jak lantionina, 3-metylolantionina, 2,3-didehydroalanina oraz kwas α-aminomasłowy.
Te nienasycone i odwodnione reszty charakteryzuje obecność elektrofilowego centrum, które może reagować z sąsiadującymi resztami nukleofilowymi, dając w konsekwencji policykliczną strukturę. Taka struktura ma duże znaczenie dla odpowiedniego działania bakteriocyny i jej właściwości wiązania się z błoną komórkową bakterii wrażliwych. Przypuszczalnie także utrzymuje odpowiednią sztywność nizyny, chroni przed proteolizą i termiczną denaturacją. Poznano i scharakteryzowano do tej pory sześć form nizyny, oznaczonych literami alfabetu od A do E, oraz formę Z. Największa aktywność antydrobnoustrojowa cechuje nizynę A. Na przykład nizyna Z różni się od nizyny A jedynie tym, iż reszta histydynowa zamieniona jest na resztę kwasu asparaginowego.
Nizyna produkowana jest przez szczepy Lactococcous lactis i wywiera swą antydrobnoustrojową aktywność na szeroką gamę bakterii Gram-dodatnich. Nie wykazuje właściwości antybiotycznych wobec bakterii Gram-ujemnych, drożdży czy grzybów (21). Nizyna stanowiła swego czasu potencjalną kandydatkę do użycia jako antybiotyk. Jednakże zdyskwalifikowały ją relatywnie wąskie, w porównaniu z antybiotykami spektrum aktywności, a także niska stabilność w fizjologicznym pH i wrażliwość na proteazy trawienne. Wiele cech strukturalnych i biologicznych czyni jednak z nizyny doskonały, naturalny konserwant spożywczy. Oficjalnie, jako biokonserwant, nizyna uznana została już w ponad 50 państwach na świecie. Używana jest przede wszystkim do hamowania wzrostu bakteryjnych spor w szerokiej gamie produktów spożywczych, a w szczególności w serach dojrzewających czy konserwach warzywnych i owocowych. Fizykochemiczne właściwości nizyny pozwalają jej na utrzymanie odpowiedniej struktury, stabilności i aktywności w wysokiej temperaturze i w niskim pH nawet przez dłuższy czas. Tak więc nie jest wrażliwa na pasteryzację, czy tyndalizację żywności, która znacznie zwiększa podatność bakteryjnych spor na działanie nizyny. Jako konserwant używana jest głównie wśród takich produktów jak (22):
- Sery dojrzewające, w których nizyna zapobiega wzrostowi spor produkowanych przez Clostridium tyrobutyricum.
- Mleko, w szczególności w krajach o gorącym klimacie gdzie zachodzi potrzeba transportu mleka na większe odległości, a warunki chłodzenia są niewystarczające. W tym przypadku nizyna prawie dwukrotnie zwiększa okres przydatności mleka do spożycia, zapobiegając wzrostowi spor bakterii termofilnych, potrafiących przetrwać długotrwałą pasteryzację.
- Konserwy, w których nizyna likwiduje przede wszystkim spory wytwarzane przez termofilne bakterie z gatunku Bacillus stearothermophilus oraz Clostridium thermosaccharolyticum, które mogą się rozwijać i przetrwać w konserwach nawet po długotrwałym ogrzewaniu.
- Mięso, w przypadku którego nizyna pozwala na obniżenie poziomu użycia azotanów. Dodatkowo, zastosowanie nizyny w kombinacji z innymi substancjami antybakteryjnymi, jak np. pediocyna, lub odpowiednimi technologiami obróbki skutecznie hamuje rozwój bakterii z gatunku Listeria monocytogenes (23).
- Produkty fermentacji alkoholowej, w których dodatek nizyny pozwala lepiej kontrolować procesy fermentacji i ograniczać zakażenia bakteriami fermentacji mlekowej takimi jak Lactobacillus, Pediococcus, w takich trunkach jak wino czy piwo. Dodatek nizyny w stężeniu 0,25-2,5 mg/l skutecznie zapobiega niekorzystnym zmianom. Ponieważ bakteriocyna ta nie wykazuje właściwości antymikrobiologicznej skierowanej przeciwko drożdżom, może być stosowana podczas fermentacji.
Dziś nizyna, jako jedyna wśród bakteriocyn, powszechnie uważana jest za substancję GRAS (generally recognized as safe). Światowa Organizacja Zdrowia ustaliła, że dzienna dawka nizyny dla ważącej 70 kg osoby nie powinna przekraczać 60 mg (24), aczkolwiek każdy z pięćdziesięciu krajów aprobujących nizynę jako biokonserwant w żywności ma własne regulacje prawne na ten temat.
Zastosowanie kolicyn i mikrocyn
Trzoda chlewna, bydło, drób, czy inny żywy inwentarz hodowany w celach komercyjnych jest bardzo narażony na wszelkiego rodzaju infekcje bakteryjne. Niektóre patogeny są szkodliwe także dla ludzi. Dla przykładu, szczepy Salmonella enteretidis o serotypie Typhimirium, czy Eschierichia coli O157:H7, powodują silne infekcje przewodu pokarmowego zarówno u ludzi jak i u zwierząt. Szczepy gatunku Salmonella oraz Campylobacter są powodem 90% zatruć pokarmowych na świecie (25). Drób i produkty drobiowe były swego czasu powodem największej ilości zatruć pokarmowych i to one zostały okrzyknięte grupą roznosicieli Salmonella czy Campylobacter, aczkolwiek zwierzęta domowe także stanowią potencjalne źródło bakterii tych gatunków. Producenci walczą z infekcjami używając tradycyjnych antybiotyków, jak penicyliny czy tetracykliny. W rzeczywistości jednak zastosowanie tradycyjnych antybiotyków posiada wady, bowiem wiele szczepów uodparnia się szybko na ich działania, poza tym, z racji ich szerokiego spektrum działania, antybiotyki zabijają także naturalną florę bakteryjną układu pokarmowego u zwierząt. Tak więc ważnym krokiem w ochronie zdrowia zwierząt, ludzi, bezpieczeństwie żywności, jest zastosowanie do terapii, takiej substancji o aktywności antydrobnoustrojowej, której spektrum działania będzie ściśle określone i na którą bakterie nie mogą nabyć odporności. Antybiotyki nie spełniają się w tej roli, dlatego zaproponowano użycie niektórych bakteriocyn w nowoczesnych terapiach antybakteryjnych. Bakteriocyny produkowane przez bakterie Gram-ujemne znajdują zastosowanie w takich gałęziach przemysłu spożywczo-rolnego jak:
a) Hodowla drobiu.
Mikrocyny produkowane przez różne szczepy E. coli odgrywają dużą rolę w zapobieganiu zakażeniom kurcząt bakteriami Salmonella, bowiem mikrocyny są w stanie zahamować wzrost patogennych szczepów Salmonella. Ponadto komórki producentów, czyli E. coli,są w stanie przetrwać i produkować mikrocyny w warunkach niedoboru składników pokarmowych, w ekstremalnie kwaśnym środowisku, w obecności żółci i enzymów proteolitycznych (26). Niektóre szczepy E. coli modyfikowane genetycznie do produkcji mikrocyny 24, mogą być używane in vivo do inhibicji wzrostu Salmonella. Niektóre szczepy E. coli są także odpowiedzialne za infekcje układu oddechowego, wynikiem których są różnorodne choroby. Dowiedziono, iż większość wirulentnych szczepów E. coli produkuje mikrocynę V (27). Ponadto, wprowadzenie plazmidu kodującego mikrocynę V do zwykłych komórek E. coli, znacznie zwiększa ich wirulencję i prawdopodobieństwo wystąpienia spowodowanej przez nie infekcji. Tak więc mikrocyny mogą służyć także jako markery wskazujące na obecność patogenów w hodowli.
b) Hodowla bydła.
W szczególności cielęta są rezerwuarem bardzo wirulentnego szczepu bakterii E. coli O157:H7. Szczep ten produkuje toksynę shiga, która jest szczególnie niebezpieczna dla dzieci, bowiem powodować może opuchnięcia nerek, odklejanie się od nich nabłonka, czy ostre krwotoczne zapalenia okrężnicy. Terapie antybiotykowe w przypadku tego szczepu powodują intensywniejsze wydzielanie toksyny shiga, zwiększając tym samym poziom wirulencji bakterii (28). W walce z proliferacją E. coli O157:H7 kolicyny i mikrocyny stosować można w dwóch postaciach. Jako probiotyki, czyli poprzez wprowadzanie bakteriocynnogennych szczepów do zakażonych organizmów, bądź w postaci czystych, wyizolowanych substancji o aktywności antybiotycznej. Obydwa rodzaje zastosowań dają zadowalające efekty. Mikrocyny i kolicyny wykazują swoją aktywność przeciwko szczepom produkującym toksynę shiga, a także przeciwko innym szczepom E. coli o serotypie O powiązanych z ludzkimi chorobami. Toteż dodawanie kultur bakterii produkujących kolicyny i mikrocyny, jako probiotyki może znacznie redukować poziom patogenów w przewodzie pokarmowym bydła, a tym samym chronić przed zakażeniem się patogennymi szczepami.
c) Konserwowanie żywności.
Wadą wspomnianej i opisywanej już wcześniej nizyny, oraz innych bakteriocyn syntezowanych przez bakterie Gram-dodatnie jest to, iż są one aktywne tylko przeciw bakteriom Gram-dodatnim. Podczas gdy za psucie się żywności odpowiadają także bakterie Gram-ujemne, jak choćby gatunki Aeromonas, Yersinia, Pseudomonas, Salmonella, czyEscherichia. Żadna z bakteriocyn produkowanych przez LAB nie jest w stanie temu przeszkodzić. Jednakże mikrobiolodzy znaleźli na to radę, otrzymując bakteriocynę produkowaną przez LAB, której spektrum aktywności zachodzi także na bakterie Gram-ujemne. Z pomocą przyszła im, syntezowana przez E. coli mikrocyna V. Gen kodujący mikrocynę V, wklejony został do genów kodujących prebakteriocynę, w klastrze genowym bakterii LAB (29). Otrzymano w ten sposób bakteriocynę produkowaną przez bakterie Gram-dodatnie o aktywności mikrocyny V, która mogła zostać użyta do ochrony żywności przed bakteriami Gram-ujemnymi i wydłużać datę przydatności do spożycia np. mięsa, czy mleka.
Wzrost i rozpowszechnienie uodpornionych na działanie antybiotyków patogenów skłania do poszukiwań nowych substancji o aktywności antybiotycznej i stymuluje do zwiększonego wysiłku nad badaniami substancji już znanych, jak kolicyny i mikrocyny. Takie badania podążają trzema ścieżkami. Poszukiwane są zupełnie nowe substancje antydrobnoustrojowe, bądź już znane, poszukiwane są w niezbadanych źródłach. Dąży się do chemicznego zsyntetyzowania znanych bakteriobójczych substancji i ich pochodnych. Do badań wkracza także co raz częściej inżynieria genetyczna, próbująca połączyć odrębne cechy różnych bakteriocyn, poprzez wycinanie poszczególnych elementów kodujących te cechy i łączenie ich w jeden wspólnie ekspresjonowany klaster genowy. Przykładem takiego konstruktu genowego może być połączenie formującej pory w błonie komórek wrażliwych kolicyny Ia, z feromonem agrD produkowanym przez bakterie Staphylococcus aureus. Produktem takiej fuzji jest feromonicyna hamująca in vitro wzrost zarówno dzikich szczepów Staphylococcus aureus, jak i dwóch odpornych na antybiotyki.
Ważnym zjawiskiem jest apoptoza, zwana także programowalną śmiercią komórki. Odpowiednia regulacja i przeprowadzanie apoptozy jest zasadniczym procesem dla każdej komórki i fizjologii całego organizmu. Zaburzenia apoptozy mogą objawić się w postaci chorób takich jak, różne odmiany nowotworów, choroby autoimmunologiczne, czy degeneracje układu nerwowego. Niektóre kolicyny i mikrocyny dzielą wspólne cechy z białkami indukującymi apoptozę (30), dzięki czemu same mogą być odpowiedzialne za stymulowanie programowalnej śmierci komórki. W rezultacie te cechy czynią z bakteriocyn atrakcyjne narzędzia do dokładniejszego poznania i zrozumienia procesu apoptozy. Niektóre bakteriopochodne czynniki wirulentne indukujące apoptozę posiadają wiele cech wspólnych z bakteriocynami formującymi pory w błonach komórek wrażliwych. Na przykład mikrocyna E294, produkowana przez Klebsiella pneumoniae, w ludzkich liniach komórkowych wywołuje zmiany biochemiczne i morfologiczne typowe dla apoptozy (31). Po apoptozie aktywowana jest specyficzna rodzina białek, które podczas apoptozy pełnią funkcję białek efektorowych. Są to kaspazy i Bcl-2. Kaspazy odpowiedzialne za fragmentację DNA wykazują szereg podobieństw do cytotoksycznej domeny mikrocyny E9 (32). Także białka z rodziny Bcl-2 regulujące apoptozę, poprzez permeabilizację błon organelli komórkowych, przypominają strukturalnie toksyczne domeny kolicyn formujących pory w komórkach docelowych (33).
Kolicyny i mikrocyny były intensywnie badane już w połowie ubiegłego wieku. Aczkolwiek dopiero niedawno odkryto drzemiący w nich ogromny potencjał, możliwy do wykorzystania w rolnictwie, bioremediacji, ochronie ludzkiego zdrowia itp. Ta wielka i zróżnicowana rodzina związków antybakteryjnych ma dużą szansę stać się nową generacją leków.
Wady i zalety stosowania bakteriocyn w przemyśle spożywczym
Pierwszą zaletą używania bakteriocyn jako dodatku do żywności jest to, iż już stanowią one jeden z powszechnych składników zarówno ludzkich jak i zwierzęcych pokarmów, bowiem codzienny pokarm, taki jak mięso czy produkty mleczne, jest bogatym źródłem bakteriocynogennych bakterii. Z racji, iż bakteriocyny są związkami natury białkowej spodziewać się można, że część z nich podatna będzie na proteolizę, przechodząc przez układ trawienny. Tak więc, niektórych bakteriocyn nie powinno się stosować jako dodatku do żywności, gdyż prawdopodobnie zostaną inaktywowane przez enzymy trawienne.
Ogromna część bakteriocyn charakteryzuje się dużą wytrzymałością na wysoką temperaturę, dzięki której przetrwać może termiczne procesowanie żywności. Odporność na skrajne wartości pH, i z kolei niską temperaturę, jest także zaletą wykorzystywaną przy produkcji zakwaszanych produktów spożywczych, bądź żywności mrożonej.
Genowe determinanty produkcji bakteriocyn i odporności na nie zostały scharakteryzowane, dla najlepiej znanych bakteriocyn. Dzięki tej wiedzy możliwe jest przenoszenie genów kodujących bakteriocyny do kolonii nie zdolnych do ich produkcji, umożliwiając w ten sposób produkcję in situ. Szczególne znaczenie mają tu takie bakteriocyny, których geny ulokowane są na możliwych do przenoszenia elementach, jak transpozon dla nizyny, czy plazmid koniugacyjny w przypadku laktycyny 3147.
Potencjalną wadą bakteriocyn jest ich hydrofobowość, przez co mogą one powodować podział organicznej fazy tłuszczowej w produktach spożywczych. Większość bakteriocyn jest cząsteczkami niewielkich rozmiarów i pomimo swej hydrofobowości mogą łatwo dyfundować do fazy wodnej w produktach spożywczych. Niemniej jednak, po tym jak bakteriocyny zwiążą się z jakąś przestrzenią w pokarmie obserwuje się spadek ich aktywności. Specyfika produktów spożywczych może stanowić wiele przeszkód dla stosowania bakteriocyn. Mogą one być nierównomiernie rozprowadzane w produkcie, posiadać złą rozpuszczalność, wrażliwość na enzymy w pokarmie, czy sól, bądź inne składniki wpływające na obniżenie aktywności.
Warto także wspomnieć, iż dla większości bakteriocyn różnorodność docelowych podatnych na ich działanie szczepów jest bardzo duża, i nawet wewnątrz jednego gatunku różne szczepy mogą wykazywać różne poziomy podatności. Ponadto wewnątrz szczepów mogą wzrastać spontanicznie mutanty odporne na bakteriocyny. Jednakże, w dobrze procesowanej żywności nie notuje się wysokich poziomów patogennych bakterii, gdyż częstotliwość występowania spontanicznych mutantów odpornych na bakteriocyny wynosi 10-6 – 10-8.
Innym problemem związanym z zastosowaniem bakteriocyn w przemyśle jest niechęć producentów do wypróbowywania nowych metod i technologii, wymagających wkładów finansowych, w przypadku bakteriocyn testów toksykologicznych, często obarczonych ryzykiem niepowodzenia. Spowodowane to jest nieświadomością, bowiem np. dla nizyny nie stwierdzono żadnej toksyczności w stosunku do człowieka. Co więcej, ulega ona inaktywacji już po 10 minutach od kontaktu ze śliną. Nie stwierdzono także właściwości uczulających, ani zdobywania odporności krzyżowej charakterystycznej dla antybiotyków.
Literatura:
1. Klaenhamer, T. R. Genetics of bacteriocins produced by lactic acid bacteria. FEMS Microbiol Rev. 1993, 12, 39-86.
2. Piard, J. C. i Desmazeaud, M. Inhibiting factors produced by lactic acid bacteria II. Bacteriocins and other antibacterial substances. Lait. 1992, 72, 113-142.
3. Daw, M. A. i Falkiner, F.R. Bacteriocins: nature, function, and structure. Micron. 1996, 27, 467-479.
4. Jacob, F., Siminovitch, L. i Wollman, E. Sur la biosynthese d'une colicine et sur son mode d'action. Ann Inst Pasteur. 1952, 83, 295-305.
5. Nes, I.F. i Tagg, J.R. Novel lantibiotics and their prepeptides. Antonie van Leeuwenhoek. 1996, 69, 89-97.
6. Padilla, C., Salazar, M. i Faundez, O. Range of action and genetic bacteriocin codification of Pseudomonas aeruginosa isolated from three different ecological niches. J Appl Bacteriol. 1992, 73, 497-500.
7. Dykes, G.A. Bacteriocins: ecological and evolutionary significance. Trends Ecol Evol. 1995, 10, 186-189.
8. Smith, D.R. i Dworkin, M. Territorial interactions between two Myxococcus Species. J Bacteriol. 1994, 176, 1201-1205.
9. Cleveland, J., i inni. Bacteriocins: safe, natural antimicrobials for food preservation. Int J Food Microbiol. 2001, 71, 1-20.
10. Frederiq, P. Colicins. Ann Rev Microbiol. 1957, 11, 7-22.
11. Reeves, P. The bacteriocins. Bacteriol Rev. 1965, 29, 24-45.
12. Bradley, D. Ultrastructure of bacteriophage and bacteriocins. Bacteriol Rev. 1967, 31, 230-314.
13. Tagg, J.R., Dajani, A.S. i Wannamaker, L.W. Bacteriocins of Gram-positive bacteria. J Appl Bacteriol. 1976, 40, 722-756.
14. Jack, R. W, Tagg, J. R. i Ray, B. Bacteriocins of Gram-Positive Bacteria. Microbiol Rev. 1995,52, 171-200.
15. van Kraaij, C., i inni. Lantibiotics: biosynthesis, mode of action and applications. Nat Prod Rep. 1999, 16, 575-587.
16. Gwiazdowska, D. i Trojanowska, K. Bakteriocyny – właściwości i aktywność przeciwdrobnoustrojowa. Biotechnologia. 2005, 1, 114-130.
17. Chen, H. i Hoover, D. G. Bacteriocins and their Food Applications. Compr Rev Food Sci Food Safety. 2003, 2, 82-96.
18. Šmarda, J. i Šmajs, D. Colicins—exocellular lethal proteins of Escherichia coli. Folia Microbiol. 1998, 43, 563-582.
19. Braun, V., Patzer, S.I. i Hantk, K. Ton-dependent colicins and microcins: modular design and evolution. Biochimie. 2002, 84, 365–380.
20. Pons, A.-M., i inni. New developments in non-post translationally modified microcins. Biochimie. 2002, 84, 531–537.
21. Delves-Broughton, J., Blackburn, P. i Evans, R.J. Applications of the bacteriocin, nisin. Antonie van Leeuwenhoek. 1996, 69, 193-202.
22. Hill, C., O’Keeffe, T. i Ross, P. Bacteriocins. w: Encyclopedia of Dairy Science. H. Roginski, J. Fugnay i P. Fox, wyd.,New York, Academic Press, 2002, 128-135.
23. X.T., Ming, i inni. Bacteriocins applied to food packaging materials to inhibit Listeria monocytogenes on meats. J Food Sci. 1997, 62, 413-415.
24. Hurst, A. i Hoover, D.G. Nisin. w: Antimicrobial in Foods. A.L., Branen i P.M., Davidson, wyd., New York, Marcel Dekker, 1993, 369-394.
25. Trevejo, R.T. i inni. Epidemiology of salmonellosis in California, 1990-1999: Morbidity, mortality, and hospitalization costs. Am J Epidemiol. 2003, 157, 48-57.
26. Portrait, V., i inni. Inhibition of pathogenic Salmonella enteretidis growth mediated by Escherichia coli microcin J25 producing strains. Can J Microbiol. 1999, 45, 168-175.
27. Nolan, L.K. i inni. Resistance to serum complement, iss, and virulence of avian Escherichia coli. Vet Res Commun. 2003, 27, 101-110.
28. Walterspiel, J.N. i inni. Effect of subinhibitory concentrations of antibiotics on extracellular Shiga-like toxin I. Infect Immun. 1992, 20, 25-29.
29. McCormick, J.K., Klaenhammer, T.R. i Stiles, M.E. Colicin V can be produced by lactic acid bacteria. Lett Appl Micribiol. 1999, 29, 37-41.
30. Savill, J. i Fadock, R.N. Corpse clearance defines the meaning of cell death. Nature. 2000, 407, 748-788.
31. Hetz, C. i inni. Microcin E 492, a channel-forming bacteriocin from Klebsiella pneumoniae, induces apoptosis in some human cell lines. Proc Natl Acad Sci USA. 2002, 99, 2696-2701.
32. Lazebnik, Y. Why do regulators of apoptosis look like bacterial toxins? Curr Biol. 2001, 11, 767-768.
33. Walker, D.C. i inni. Mutagenic scan of the H-N-H motif of colicin E9: Implications for mechanistic enzymology of colicins, homing enzymes, and apoptotic endonucleases. Nucleic Acids Res. 2002, 30, 3225-3234.
Red. Tomasz Sznerch
KOMENTARZE