O cffDNA w pigułce

Cząsteczki cffDNA obecne w osoczu oraz surowicy kobiety ciężarnej są krótkie (kilkadziesiąt nukleotydów) i dość znacznie pofragmentowane. Pochodzą głównie z łożyska, ale ich niewielka ilość może również brać się z płynu owodniowego oraz z apoptozy płodowych komórek. DNA to wykrywane jest już około 4,5 tygodnia po zapłodnieniu i jego ilość systematycznie rośnie wraz z wiekiem ciąży. Koło 10 tygodnia, dzięki dwukierunkowej wymianie między matką a dzieckiem stanowi już około 10% puli całkowitego cfDNA znajdującego się w krwioobiegu ciężarnej. Bardzo ważną właściwością płodowych wolnych odcinków DNA jest ich krótki czas półtrwania. Dzięki temu bardzo szybko eliminowane jest w całości z krwioobiegu matki zaraz po porodzie i nie będzie już wykryte w przypadku kolejnej ciąży.

Nieinwazyjne badania prenatalne oparte na cffDNA

            Nowa era nieinwazyjnych badań prenatalnych (ang. Non-invasive prenatal testing – NIPT) zaczęła się już parę lat temu. Początkowe badania opierały się przede wszystkim na analizach PCR poprzez wykrywanie sprzężonych z płcią (z chromosomem Y) chorób genetycznych oraz określenie czynnika Rh (w przypadku kobiet posiadających grupę Rh-). Dawało to pewność, że badany materiał w całości pochodzi od płodu, nie od matki. W przypadku badania aneuploidii największym wyzwaniem okazało się odróżnienie sekwencji matczynych od płodowych. W związku z trudnościami na tym polu wykorzystuje się tu techniki sekwencjonowania nowej generacji MPS (ang. Massively Parallel Sequencing) Metoda polega na jednoczesnym namnożeniu i sekwencjonowaniu całego badanego materiału DNA. Kolejnym krokiem jest zliczenie i zestawienie regionów chromosomowych z dostępnymi bazami danych genomu ludzkiego. Dzięki skomplikowanym analizom statystycznym porównuje się ilościowo fragmenty DNA odpowiadające danym chromosomom. Jeśli ilość fragmentów jest różna od oznaczonych we wzorcu – można mieć do czynienia z aneuploidią. Drugą metodą wykorzystywaną w tej technice jest analiza SNP (ang. Single Nucleotide Polymorphizm). Polega na sekwencjonowaniu i analizie ilościowej konkretnych fragmentów wybranych chromosomów. W przypadku trisomii płodowej w krwi matki wzrasta proporcja uzyskanych wyników w stosunku do wzorca.

            Już w 1997 roku wykryto obecność pozakomórkowych fragmentów DNA płodu (ang. cell free fetal DNA – cffDNA) w krwi matki. Dało to nadzieję na opracowanie nowych, nieinwazyjnych metod diagnostyki prenatalnej. Wcześniejsze badania w tej dziedzinie dotyczyły przede wszystkim całych komórek płodowych (komórki trofoblastu, jądrzaste erytrocyty, leukocyty), które znajdują się w krwi kobiety ciężarnej. Metoda, mimo początkowych obiecujących wyników, nie zalazła zastosowania w praktyce, przede wszystkim z powodu znacznych trudności w izolacji (małe stężenie cząsteczek płodowych w krwi ciężarnej, problem z odróżnieniem komórek matki i dziecka oraz ich długi czas „życia” w matczynym obiegu już po porodzie). Sukces jednak osiągnęły jednak badania dotyczące cffDNA. O metodzie nieinwazyjnej diagnostyki prenatalnej opartej na analizie DNA płodu z krwi ciężarnej opowiada dla portalu biotechnologia.pl Profesor Diana W.Bianchi, Dyrektor wykonawczy Instytutu Badań Matki i Niemowląt w Floating Hospital for Children at Tufts Medical Center – "Badanie jest głównie wykorzystywane do wykrywania aneuploidii autosomalnych, ale jest coraz częściej wykorzystywane także do wykrywania aneuploidii chromosomów płci i determinacji płci płodu. Nieinwazyjne wykrywanie anomalii sub-chromosomowych dopiero początek. "

            Technika oparta na analizie cffDNA w krwi matki umożliwia na dzień dzisiejszy wykrycie takich wad płodu jak trisomie chromosomów 13, 18, 21, X i Y oraz monosomię chromosomu X. Test charakteryzuje się bardzo wysoką czułością (na poziomie 99% dla trisomii chromosomu 21) i specyficznością. Mimo ciągłego doskonalenia metody występują jednak jeszcze wyniki fałszywie pozytywne, które muszą być weryfikowane za pomocą dodatkowych badań.

Test NIFTY oparty na wyżej wymienionych metodach jest już dostępny w Polsce. O jego zastosowaniu, oraz planach na przyszłość związanych z tego typu diagnostyką opowiedział dla poralu biotechnologia.pl  Matt Poulter, Product Marketing Manager BGI Europe – "NIFTY to bardzo dokładny, nieinwazyjny test prenatalny, wykorzystujący technologię sekwencjonowania najnowszej generacji. Podczas testu analizowane jest DNA płodu, znajdujące się w krwi matki. W wyniku tego badania, określane jest ryzyko wystąpienia trisomii, aneuploidii chromosomów płci i mikrodelecji płodu. Prace nad rozwojem możliwości testu prowadzone są nieustannie, i w najbliższym czasie NIFTY zostanie wzbogacony o dodatkowe możliwości. Mamy nadzieję, że wszystkie mamy będą miały ułatwiony dostęp do NIPT , jako części ich opieki zdrowotnej. Aby ułatwić kobietom dostęp do najnowszych możliwości testów NIFTY, BGI Europe współpracuje na polskim rynku z firmą Genomed S.A."

Zalety i ograniczenia metody

            Podstawową zaletą testu jest jego duża swoistość (krótki czas półtrwania cffDNA), oraz wysoka czułość w porównaniu do innych metod. Profesor Diana W.Bianchi dodaje – „Nieinwazyjne badania prenatalne wykorzystujące sekwencjonowanie bezkomórkowego płodowego DNA są najbardziej dokładnymi testami do wykrywania trisomie 21, 18 i 13. Prawie 100% wartość predykcyjna dodatnia oznacza, że ​​kobiety, które mają negatywny wynik testu nie muszą już potwierdzać wyniku przez procedury inwazyjne. " Ponadto technika jest całkowicie bezpieczna dla matki i płodu – całość polega na pobraniu od ciężarnej ok. 10ml krwi. Nie jest potrzebna na tym etapie obecność lekarza specjalisty. Bardzo ważną zaletą testu jest także fakt, że bada on bezpośrednio DNA płodu, a nie jak w przypadku standardowo stosowanych dotychczas testów przesiewowych czynniki mogące świadczyć o nieprawidłowościach genetycznych (markery USG, stężenia białek). Ważne jest również, że badanie możemy wykonać bardzo szybko, nawet w 10 tygodniu ciąży, jednocześnie nie ma również wyraźnych ram czasowych ograniczających jego wykonanie (można poddać analizie krew pacjentki, która ze względu na wiek ciąży nie klasyfikuje się już do innych badań przesiewowych)

Największą wadą metody na dzień dzisiejszy jest niestety cena samego zabiegu. Profesor Diana W Bianchi komentuje jednak – „Obecnie, badanie jest droższe niż testy przesiewowych, ale dla kobiet z grupy wysokiego wysokiego ryzyka, koszty ogólne są neutralne ze względu na spadek procedur inwazyjnych." Wiąże się to m.in. z koniecznością wysyłania próbek za granicę, ponieważ w Polsce nie ma jeszcze odpowiedniego sprzętu do takich badań. Matt Poulter dodaje – „Chcielibyśmy aby najwyższej jakości opieka prenatalna była dostępna dla wszystkich, a nie stanowiła tylko domenę tych, którzy mogą sobie na nią pozwolić. W niektórych krajach prenatalne badania genetyczne dla kobiet ze zwiększonymi czynnikami ryzyka są już swobodnie oferowane w ramach krajowego systemu opieki zdrowotnej.”

Mimo wysokiej czułości nadal występują również jednak wyniki fałszywie pozytywne (wraz z rozwojem metody cały czas procent ten się zmniejsza), które powinny być dodatkowo weryfikowane innymi metodami. „Testy NIPT, takie jak NIFTY odgrywają ważną rolę w medycynie poprzez zmniejszenie liczby niepotrzebnych zabiegów inwazyjnych, takich jak amniopunkcja, które niosą ze sobą ryzyko poronienia. Jednak, pomimo bardzo wysokiego poziomu dokładności tych metod, należy zauważyć, że NIFTY nadal klasyfikuje się jako badanie przesiewowe i każdy wynik wysokiego ryzyka powinien być dodatkowo potwierdzony przez inwazyjne badania diagnostyczne. Dlatego w chwili obecnej oraz w najbliższej przyszłości, inwazyjne procedury diagnostyczne w dalszym ciągu będą jeszcze odgrywać istotną rolę w prenatalnych badaniach genetycznych.” – dodaje Matt Poulter.

Test oparty na badaniu cffDNA w krwi matki jest stosunkowo nowy (na rynku działa około 3-4 lat), jednak daje duże nadzieje na przyszłość. Bardzo możliwe, że już niedługo stanie się o wiele bardziej powszechny i zastąpi dotychczas wykonywane nieinwazyjne testy przesiewowe, a także część inwazyjnych. „Uważamy, że ruch w kierunku "spersonalizowanej opieki zdrowotnej " jest jednym z najbardziej ekscytujących wydarzeń dzisiejszej medycyny, a nawet określa praktykę lekarską w 21 wieku.” – podsumowuje Matt Poulter.