Biotechnologia.pl
łączymy wszystkie strony biobiznesu
Apoptoza – molekularny opis szlaków
Istnieje kilka rodzajów śmierci komórek organizmu, różniących się mechanizmem, czynnikami sprawczymi oraz częstością występowania. Wśród typów śmierci komórkowej wyróżniamy m.in.: apoptozę, nekrozę, pyroptozę czy autofagię. Najczęstszym typem śmierci, na który komórka jest skierowana świadomie, popełniając jakby samobójstwo jest apoptoza. W szlakach indukcji apoptozy bierze udział wiele białek, których mutacja może stanowić o nieśmiertelności komórek i w efekcie o rozwoju choroby nowotworowej na drodze niezahamowanych podziałów komórkowych. Poniżej zostaną przybliżone mechanizmy, na których drodze komórka wchodzi na drogę programowanej śmierci.

 

Kaspazy

Wyróżniamy kilka dróg aktywacji apoptozy: wewnętrzną, zewnętrzną, pseudoreceptorową, retikulum endoplazmatycznego. W przebiegu każdej z tych dróg biorą udział enzymy z rodziny endopeptydaz zwane kaspazami [1]. Charakterystyczną cechą wszystkich kaspaz jest miejsce cięcia łańcucha białkowego zawsze po reszcie kwasu asparaginowego i zależy od reszt cysteiny występujących w miejscu aktywnym enzymu. Ponadto wytwarzane są w postaci prokaspaz wymagających aktywacji. Ogólnie rodzinę kaspaz biorących udział w procesie apoptozy można podzielić na inicjatorowe (kaspaza 2, 8, 9, 10 i 12) oraz efektorowe (kaspaza 3, 6 i 7). Kaspazy inicjatorowe występują w postaci nieaktywnych monomerów, które ulegają aktywacji poprzez dimeryzację w przeciwieństwie do kaspaz efektorowych, które w postaci nieaktywnej stanowią dimery ulegające aktywacji poprzez cięcie proteolityczne przez te pierwsze, a następnie aktywowana kaspaza efektorowa może aktywować inne na zasadzie dodatniego sprzężenia zwrotnego.

 

Szlak wewnętrzny

Szlak wewnętrzny zwany jest inaczej szlakiem mitochondrialnym [2,4], ze względu na główny udział tego organellum w aktywacji apoptozy. Na skutek działania czynników stresowych takich jak: stres oksydacyjny, uszkodzenie DNA, wzrost poziomu jonów wapnia, patogenów, nieprawidłowo sfałdowanych białek czy leków cytotoksycznych, za regulację szlaku mitochondrialnego apoptozy są odpowiedzialne białka z rodziny Bcl-2, wśród których wyróżniamy białka proapoptotyczne ( Bax, Bak, Bok, Bim, Bid, Bik, Bad, Bmf, Hrk, Noxa, Puma, Blk) i antyapoptotyczne (Bcl-2, Bcl-XL, Bcl-w, A1, Mcl-1). Zaburzenie równowagi, spowodowane czynnikami uszkadzającymi pomiędzy tymi grupami, kieruje komórkę na szlak apoptozy.

Następnie następuje napływ białek proapoptotycznych i destabilizacja błony mitochondrialnej na skutek tworzących pory w błonie zewnętrznej mitochondrium oligomeryzujących białek Bax lub Bak. W naturalnych warunkach białka te są nieaktywne dzięki związaniu z białkami antyapoptotycznymi Bcls i Bcal-XL, które jednak w przypadku działania czynników uszkadzających ulegają inaktywacji poprzez fosforylację.

Dla białek Noxa oraz PUMA przypada natomiast rola pomocnicza odbywająca się poprzez hamowanie działanie białek antyapoptotycznych w przypadku Noxa oraz zwiększenia ekspresji oraz zmian konformacyjnych Bax usprawniających tworzenie porów w błonie w przypadku PUMA.

W przypadku uszkodzenia materiału genetycznego komórki niemożliwego do naprawy, następuje zatrzymanie podziału komórki i napływ białka P53 („strażnika genomu”) do mitochondrium, gdzie tworzy kompleks z białkami antyapoptotycznymi Bcl-2/Bcl-XL, promując działanie białka Bax i tworzenie porów w błonie mitochondrialnej.

Działania te w obu przypadkach prowadzą do zaburzenia integralności mitochondrium oraz spadku potencjału mitochondrialnego, co w konsekwencji powoduje uwolnienie białek proapoptotycznych z mitochondrium, do których należą: cytochrom c (zwany czynnikiem Apaf-2), Smac/DIABLO, HtrA2/Omi oraz AIF, Endonukleaza G i CAD. Zaburzeniu ulega ponadto produkcja ATP, glutation oraz NADH i NADPH przechodzą w formę utlenioną i wytwarzane są w nadmiarze reaktywne formy tlenu (ROS), powodując następnie utlenianie składników komórki takich jak: lipidy, białka czy kwasy nukleinowe.

Następuje ponadto zwiększony napływ jonów wapnia do mitochondrium, co działając wspólnie z wspomnianymi czynnikami, powoduje modyfikację i otwarcie megakanałów (MPTP) znajdujących się na styku wewnętrznej i zewnętrznej błony mitochondrialnej. MPTP zbudowne są z napięciowozależnych kanałów jonowych (VDAC), translokazy nukleotydów adeninowych (ANT) oraz cyklofiliny D (CyD). ROS powodują modyfikację grup tiolowych ANT, natomiast Bax i Bak oddziałują z VDAC powodując zwiększenie wielkości porów, pozwalając na uwalnianie cytochromu c.

Innym możliwym mechanizmem jest zależny od tBid proces tworzenia kanałów ceramidowych, powodując także uwolnienie cytochromu c. Poza tym tBid prawdopodobnie bierze także udział w tworzeniu MPTP i przebudowie mitochondriów.

Cytochrom C jest związany po zewnętrznej stronie wewnętrznej błony mitochondrialnej z ujemnie naładowaną kardiolipiną. Na skutek utleniania, kardiolipina zmniejsza swoje powinowactwo do cytochromu c, pozwalając w ten sposób na uwolnienie do cytozolu, gdzie tworzy razem z czynnikiem Apaf-1 oraz prokaspazą-9 apoptosom, w którym następuje aktywacja kaspazy-9. Końcowym efektem jest aktywacja kaspazy-3 i końcowa aktywacja apoptozy.

Dodatkowo białka Smac/DIABLO i HtrA2/Omi hamują działanie białek inhibitorowych apoptozy (IAP), dzięki czemu pośrednio promują apoptozę poprzez wpływ na aktywację kaspazy-3. W przeciwieństwie do tego białka AIF, Endonukleaza G oraz CAD nie oddziałują z kaspazami – bezpośrednio wędrują do jądra komórkowego prowadząc do rozcinania DNA na krótkie fragmenty.

 

Szlak zewnętrzny

Zewnętrzny szlak apoptozy [2], ze względu na mechanizm działania jest zwany także szlakiem receptorowym. W tym przypadku, pod wpływem czynników uszkadzających, komórka poprzez błonowy receptor, należący do rodziny receptora czynnika martwicy nowotworów (TNF), odbiera ze środowiska sygnał inicjujący szlak apoptozy. Receptor ten składa się z części zewnątrzkomórkowych domen bogatych w cysteinę oraz 80 aminokwasowej, cytoplazmatycznej „domeny śmierci”. Najlepiej poznane są mechanizmy związane z FasL/FasR oraz TNF-α/TNFR1. Po przyłączeniu liganda do receptora TNFR1 następuje jego aktywacja poprzez trimeryzację i zmiany konformacyjne. Następnie cytoplazmatyczna domena śmierci - TRADD (TNFR - associated death domain) ulega uwolnieniu i bierze udział poprzez formowanie kompleksów I i II w szlakach sygnalizacyjnych przeżywalności oraz apoptozy.

W skład kompleksu I poza TRADD wchodzi RIP1 (receptor-interacting protein 1) oraz TRAF2 (TNF-receptor associated factor 2). Pod wpływem działania kompleksu I następuje szereg zmian w komórce dotyczących aktywacji kinazy 1 aktywowanej TNF-β, aktywacji czynnika NF-κB, kinazy JNK oraz białka p38. Kompleks I wpływa na przeżywalność dzięki aktywacji przez NF-κB antyapoptotycznych białek m.in. c-FLIP, Bcl-XL, inhibitora apoptozy XIAP oraz komórkowych inhibitorów apoptozy (c-IAP) 1 i 2.

Poprzez szereg zmian aktywności enzymatycznej w komórce dotyczących m.in. aktywacji kinazy regulującej sygnał apoptozy (ASK1), a także degradacji białka c-FLIP przy udziale ROS, następuje stała ciągła aktywacja kinazy JNK prowadzącej do apoptozy.

Z drugiej strony czynnik NF-κB stanowi negatywny regulator apoptozy dzięki aktywacji MKP (fosfatazę kinazy MAP) oraz Mn zależnej dysmutazy ponadtlenkowej (MnSOD), które zapobiegają gromadzeniu się ROS oraz wpływają na negatywną regulację JNK oraz przeżywalność komórek.
Opisano także wpływ domeny śmierci związanej z receptorem FAD (Daxx) na indukcję apoptozy przy udziale JNK, poprzez wpływ na aktywację kinazy ASK1.

Kompleks II formowany na skutek aktywacji receptora TNFR1 i uwolnienia części wewnątrzkomórkowej stanowiącej TRADD, składa się z TRADD, FADD (fas-associated death domain) oraz prokaspasy-8, która zostaje aktywowane dzięki wytworzeniu kompleksu DISC (Death Inducing Signaling Complex).

Ważnym punktem kontrolnym wpływającym na przeżywalność lub indukcję apoptozy jest komórkowe stężenie białek c-FLIP – wysokie stężenie hamuje aktywację kaspazy-8 przez kompleks DISC, a także RIP1 – wiąże TRADD w kompleks I, który jest rozszczepiany przy udziale aktywnej kaspazy-8. Poza wytworzeniem kompleksów I i II istnieje także alternatywna droga związana z aktywacją TNFR1, prowadząca do skierowania komórki na drogę apoptozy – wiązanie TRADD przez białko RIP i bezpośrednia aktywacja kaspazy-2.

Kolejnym możliwym szlakiem jest aktywacja FASR poprzez przyłączenie FASL. W ten sposób następuje przyłączenie prokaspazy-8 do domeny śmierci FADD poprzez dimeryzację. Następnie w wyniku autokatalizy następuje przekształcenie prokaspazy-8 w formę aktywną. Podczas aktywacji FASR dochodzi również do aktywacji apoptozy szlakiem zależnym od JNK oraz p38 dzięki zaangażowaniu Daxx, aktywującego kinazę ASK1. Po aktywacji kaspazy-8 następuje ostatnia faza wykonawcza apoptozy. Ze względu na ilość zaktywowanej kaspazy-8, możemy tę fazę podzielić na dwa typy. W typie 1 gdy ilość aktywnej kaspazy-8 jest wyższa, następuje bezpośrednia aktywacja kaspazy-3 – miejsce połączenie drogi zewnętrzną w drogą wewnętrzną. Natomiast w typie 2, gdy mamy do czynienia z niskim poziomem aktywacji kaspazy-3 poprzez kaspazę-8, następuje amplifikacja sygnału poprzez pętlę z zaangażowaniem mitochondrium. Kaspaza-8 aktywuje także białko proapoptotyczne Bid do formy aktywnej tBid, która wchodzi w interakcję z białkami Bax/Bak i przyczynia się do wzrostu przepuszczalności zewnętrznej błony mitochondrialnej. W rezultacie następuje uwolnienie cytochoromu c do cytoplazmy, a także wytworzenie ROS, które wpływają negatywnie na białko antyapoptotyczne c-FLIP – wynikiem jest promocja indukcji apoptozy.

 

Szlak pseudoreceptorowy

Poza opisanymi klasycznymi szlakami indukcji apoptozy, istnieje również szlak, w którym wykorzystywane są ziarnistości pochodzące z komórek układu immunologicznego (limfocyty Tc, komórki NK oraz neutrofile) – granzymy oraz perforyny[3,4].

Komórka układu immunologicznego po rozpoznaniu komórki docelowej, ulega przyłączeniu, polaryzacji ziarnistości oraz degranulacji. Po wniknięciu do komórki, perforyny wbudowują się w błonę komórkową tworząc kanał utworzony z około 20 podjednostek, umożliwiając swobodny przepływ jonów oraz małych białek. Wynikiem tego jest destabilizacja komórki i wprowadzenie komórki na drogę apoptozy, dodatkowo stymulowane uwolnieniem jonów wapnia.

Natomiast granzymy są proteazami serynowymi, których rola polega na aktywacji polieryzacji perforyn, degradacji białek cytozolowych i organelli komórkowych, a także degradacji chromatyny prowadzącej do udostępnienia DNA dla działania endonukleaz prowadzących do degradacji.

Granzym B rozszczepia białka zawierające reszty asparaginianowe, dzięki czemu wykazuje zdolność aktywacji kaspazy-10 oraz czynnika ICAD (inhibitor of caspase activated DNAse). Co ciekawe, jak wykazano w badaniach – granzym B jest zdolny do aktywacji białka Bid powodując destabilizację zewnętrznej błony mitochondrialnej i uwalniania cytochromu c. Poza tym granzym B może również bezpośrednio aktywować kaspazę-3.

Granzym A jest natomiast odpowiedzialny za aktywację DNAzy NM23-H1 odpowiedzialnej za apoptotyczną degradację DNA. Wspomniana DNAza odgrywa ważną rolę jako induktor apoptozy komórek nowotworowych.

 

Szlak retikulum endoplazmatycznego

Śmierć komórki wywoływana jest w tym przypadku na skutek zaburzenia równowagi jonowej (wzrost stężenia jonów wapnia) oraz poprzez nagromadzenie w komórce nieprawidłowych białek [3].

W błonie retikulum endoplazmatycznego jest zlokalizowana kaspaza-12, która jest zdolna do bezpośredniej aktywacji kaspaz wykonawczych (m.in. 7 i 8) i stanowi główny czynnik prowadzący do śmierci komórki szlakiem siateczkowym.

Indukcja apoptozy może także zachodzić na drodze niezależnej od kaspaz. W tym przypadku główną rolę pełny proteaza cysteinowa aktywowana jonami wapnia – kalpaina. Jony wapnia uwalniane z retikulum endoplazmatycznego łączą się m.in. z kalpainą, która jest zdolna do aktywacji białek proapoptotycznych Bax i Bid, prowadząc do uwolnienia białek z mitochondrium i dalszą indukcję drogą wewnętrzną.

Nieprawidłowe białka na drodze stresu endoplazmatycznego [5] mogą także powodować aktywację białka homologicznego C/EBP (CHOP), które może aktywować indukcję apoptozy poprzez uwalnianie jonów wapnia z komórki oraz wpływ na białka z rodziny Bcl-2, powodując indukcję również na drodze mitochondrialnej.
Poza tym jony wapnia mogą także aktywować kinazę białkową zależną od jonów wapnia i kalmoduliny (CaMKII), która następnie powoduje aktywację apoptozy poprzez aktywację FAS.

 

Faza wykonawcza

W fazie wykonawczej pod wpływem kaspaz efektorowych (kaspazy-3, -6, -7) następuje cięcie wielu substratów m.in. cykokeratyny, PARP, białek błony cytoszkieletu, białka jądrowego NuMA.

Główną rolę wykonawczą odgrywa kaspaza-3, która może być aktywowana na różnych drogach poprzez kaspazę-8, -9 i -10. Jest odpowiedzialna za aktywację endonukleazy CAD poprzez jej uwolnienie z kompleksu z inhibitorem (ICAD), który w warunkach prawidłowych zabezpiecza CAD przed aktywacją. Następnie wspomniana endonukleaza degraduje DNA i powoduje kondensację chromatyny. Substrat dla kaspazy-3 stanowi ponadto białko wiążące aktynę – Gasolina, którego cięcie wpływa na zaburzenie transportu wewnątrzkomórkowego, przekazywanie sygnału oraz podziału komórek.

Kaspaza-3 powoduje także rozpad komórki i powstanie ciał apoptotycznych, na których powierzchni znajduje się fosfatydyloseryna (na skutek zaburzenia aktywności translokazy aminofosfolipidowej) rozpoznawana przez fagocyty i powodująca wychwyt ciałek apoptotycznych. Dzięki temu apoptoza nie prowadzi do reakcji zapalnej, ponieważ nie następuje uwalnianie składników komórek do przestrzeni pozakomórkowej, a powstające ciałka apoptotyczne są szybko rozpoznawane i trawione przez inne komórki.

Jak zostało opisane powyżej programowana śmierć komórki (apoptoza) stanowi bardzo skomplikowany mechanizm, ściśle regulowany na wielu poziomach w komórce. Taka kontrola zabezpiecza komórkę przed niepożądanym skierowaniem na drogę apoptozy, ale z drugiej strony powoduje, że uszkodzona komórka staje się niewrażliwa na czynniki w normalnych warunkach indukujące apoptozę. Fizjologicznie w komórce podczas replikacji raz na jakiś czas dochodzi do uszkodzenia kwasu nukleinowego. Gdy komórka nie jest w stanie poradzić sobie z naprawą jest kierowana na drogę apoptozy, jednak w przypadku uszkodzenia mechanizmu indukcji apoptozy dochodzi do powielania uszkodzonych genów, co stanowi podłoże rozwoju chorób nowotworowych.

Źródła

Literatura:

 

1. McIlwain DR, Berger T, Mak TW. „Caspase functions in cell death and disease.” Cold Spring Harb Perspect Biol. 2013 Apr 1;5(4):a008656. doi: 10.1101/cshperspect.a008656.

 

2. Sinha K, Das J, Pal PB, Sil PC. „Oxidative stress: the mitochondria-dependent and mitochondria-independent pathways of apoptosis.” Arch Toxicol. 2013 Jul;87(7):1157-80. doi: 10.1007/s00204-013-1034-4.

 

3. Roman Paduch, Maria Klatka, Janusz Klatka. „Types of cell death.” Pom J Life Sci 2015, 61, 4, 411–418

4. Elmore S. „Apoptosis: A Review of Programmed Cell Death. Toxicologic pathology.” 2007;35(4):495-516. doi:10.1080/01926230701320337.

 

5. Scull CM, Tabas I. „Mechanisms of ER Stress-induced Apoptosis in Atherosclerosis.” Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 2011;31(12):2792-2797. doi:10.1161/ATVBAHA.111.224881.

 

Grafika:

 

http://www.nature.com/nrm/journal/v12/n7/fig_tab/nrm3143_F2.html

 

http://clincancerres.aacrjournals.org/content/12/8/2390

 

https://www.researchgate.net/publication/26828205_Intracellular_versus_extracellular_granzyme_B_in_immunity_and_disease_challenging_the_dogma/figures?lo=1

 

https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Apoptosis_mouseliver.jpg

 

http://atvb.ahajournals.org/content/31/12/2792

KOMENTARZE
Newsletter