W niniejszym artykule opisujemy zastosowanie potrójnego testu Apo­Tox-Glo™ Triplex firmy Promega do utworzenia profilu cytotoksycznego substancji aktywnych w hodowlach komórkowych in vitro. Identyfikacja trzech parametrów związanych z ży­wotnością i śmiercią komórek (cyto­toksycznością) pozwala na uzyskanie biologicznie wiarygodnych wyników oraz ich lepszą interpretację.

Potrójny test ApoTox-Glo™ Triplex Assay

ApoTox-Glo™ Triplex Assay to dwu­etapowy zestaw testowy do ozna­czania żywotności, cytotoksyczności i apoptozy hodowanych komórek (ad­herentnych i nieadherentnych) w tym samym dołku mikropłytki.

W pierwszym etapie podwójny test MultiToxFluor™ pozwala na równoczesny pomiar aktywności pro­teaz charakterystycznych dla komó­rek żywych (żywotność) i martwych (cytotoksyczność). Jest to prosty test na bazie fluorescencji w roztworze homogenicznym bez potrzeby lizy komórek. Analizę komórek żywych przeprowadza się przy pomocy pep­tydowego substratu fluorogeniczne­go wnikającego do wnętrza komórek – glicylo-fenylo-alanylo-aminofluo­rokumaryny (GF-AFC). Pod wpływem proteazy, aktywnej wyłącznie w ży­wych komórkach o nienaruszonych błonach komórkowych, dochodzi do hydrolizy GF-AFC o właściwościach fluorescecyjnych. Sygnał fluorescencji jest więc proporcjonalny do ilości ży­wych komórek. Drugi fluorogeniczny substrat, nieprzenikający przez błony komórkowe – bis-(Ala-Ala-Phe)-ro­damina 110 (bis-AAF-r110), służy do pomiaru aktywności proteolitycznej specyficznej dla martwych komórek z uszkodzoną błoną plazmatyczną (pomiar cytotoksyczności). W przy­padku uszkodzenia błon plazmatycz­nych, proteaza martwych komórek przedostaje się do pożywki hodow­lanej, gdzie z bis-AAF-r110 uwalnia się produkt fluorescencyjny. Specyficzne reakcje proteaz żywych i martwych komórek rezultują w uwolnieniu fluoroforów AFC oraz r110 charakte­ryzujących się różnymi długościami fal wzbudzenia i emisji, co umożliwia ich równoległą detekcję. Obliczenie stosunku liczby komórek żywych do martwych pozwala na znormalizowa­nie danych i porównywanie wyników różnych eksperymentów (np. prze­prowadzanych w różnym czasie lub z różną liczbą komórek).

W drugim etapie testu opartym na technologii Caspase-Glo® Assay na bazie bioluminescencji oznacza­ny jest stopień apoptozy. Kaspaza-3 i kaspaza-7 stanowią kluczowe, niezależne od szlaku apoptycznego wskaźniki programowanej śmierci komór­kowej. Zawarty w zastawie testowym substrat zawiera­jący prolucyferynę oraz tetrapetydową sekwencją devd zostaje specyficznie hydrolizowany przez kaspazy-3 i 7. Uwolniona aminolucyferyna, wchodząc w enzymatycz­ną reakcję z lucyferazą, emituje światło. Mierzony sygnał jest proporcjonalny do aktywności kaspazy-3 i 7 w próbce, a więc do ilości komórek apoptycznych.

Substraty testu ApoTox-Glo™ są gotowe do użycia i do­dawane kolejno prosto do płytki z komórkami bez do­datkowych przygotowywań. Multipleksowy format testu otwiera także opcję automatyzacji w różnych systemach, umożliwiając analizy wysokoprzepustowe.

Interpretowanie mechanizmu śmierci ko­mórkowej

Substancje cytotoksyczne to przeważnie związki chemicz­ne i biologiczne działające wielokierunkowo na żywe ko­mórki i zaburzające kompleksowe procesy biologiczne. Mogą doprowadzić do indukcji śmierci komórki drogą apoptozy lub, przy większym nasileniu cytotoksycznych bodźców, do śmierci przez nekrozę. Nekrozę charaktery­zuje szybko przebiegająca utrata integralności błon ko­mórkowych oraz uwalnianie składników cytoplazmatycz­nych. W przypadku apoptozy, integralność błon zostaje zachowana i komórki te zostają usuwane in vivo przez fagocyty. Podczas interpretacji wyników eksperymentów in vitro należy pamiętać, że w przypadku nieobecności fagocytów w hodowli komórkowej, także komórki apo­ptotyczne tracą integralność swoich błon. Zjawisko to, określane nekrozą wtórną, następuje często później niż nekroza pierwotna. W zależności od substancji cytotok­sycznej i jej stężenia można obserwować także „mieszane” formy śmierci komórek – nekrotyczne i apoptotyczne. Rozróżnienie procesów nekrotycznych i apoptycznych ma duże znaczenie kliniczne, m.in. z uwagi na związa­ny z nekrozą stan zapalny oraz szkodliwe oddziaływanie czynników indukujących nekrozę na zdrowe tkanki.

Jednoczesny pomiar kilku parametrów biologicznych może zapobiec błędnej interpretacji mechanizmu śmierci komórkowej. Testy żywotności wskazują względną licz­bę żywych komórek po zastosowaniu substancji czynnej w stosunku do kontroli, którą przyjmuje się za 100%, po upływie określonego czasu. Przy użyciu jednoparametro­wego testu na żywotność lub cytotoksyczność i w przy­padku krótkich czasów oddziaływania substancji (poniżej 24 h), rozróżnienie śmierci komórek spowodowanej przez nekrozę lub apoptozę może być niemożliwe. Z uwagi na krótki czas aktywności proteaz komórek martwych, mar­kery cytotoksyczności powiązane z integralnością błony komórkowej mogą z kolei zostać przeoczone lub ich ilość zaniżona, jeśli test następuje po więcej niż 24 h oddziały­wania substancji czynnej. Oddziaływanie substancji przez 48 h może w niektórych systemach prowadzić do prze­oczenia markera kaspazy-3 i 7 z uwagi na przeminięcie zdarzenia apoptozy.

Znacznie lepszy obraz mechanizmu śmierci komórko­wej można uzyskać, jeśli markery żywotności, cytotok­syczności oraz apoptozy mierzy się w wielu punktach cza­sowych, przy zastosowaniu pojedynczej dawki substancji czynnej, lub w zoptymalizowanym punkcie czasowym, przy zastosowaniu seryjnych rozcieńczeń substancji (Wy­kres 1, 2). Pierwotna nekroza występuje zazwyczaj w ho­dowli komórek w przeciągu od 4 do 6 godzin, natomiast apoptoza w zakresie od 4 do 72 godzin.

Aby scharakteryzować różnice w profilach biomarkerów komórek nekrotycznych i apoptotycznych, użyliśmy testu ApoTox-Glo™ Triplex Assay do analizy żywotności, cytotok­syczności oraz aktywności kaspazy-3 i 7 w komórkach Jurkat po działaniu jonomycyny oraz w komórkach k562 po działaniu kamptotecyny (seryjne rozcieńczenia obu substancji). Test został przeprowadzony w optymalnym dla danego systemu punkcie czasowym (6 godzin dla komórek Jurkat z jonomy­cyną i 48 h dla komórek k562 z kamptotecyną).

W przypadku komórek Jurkat pod działaniem jonomy­cyny (Wykres 1) można zaobserwować odwrotną korelację parametrów żywotności i cytotoksyczności. Profil nie wy­kazuje jednak wzrostu markera apoptozy, czyli aktywności kaspaz-3 i 7. Taki profil cytotoksyczny wskazuje jedno­znacznie na zjawisko pierwotnej nekrozy. W drugim przy­kładzie (Wykres 2) nie obserwujemy wzrostu wskaźnika cytotoksyczności, czyli uszkodzenia błon komórkowych. Jednocześnie jednak test wykazuje obniżenie żywotności komórek oraz indukcję kaspazy-3 i 7. Taki profil potwier­dza śmierć komórek drogą apoptozy.

Interpretując profile cytotoksyczne substancji czynnych w danych komórkach, należy pamiętać, że istnieje wiele czyn­ników antyproliferacyjnych mogących skutkować obniżeniem żywotności komórek bez jednoczesnego wzrostu cytotok­syczności. Jeśli w takim przypadku nie zostanie odnotowany wzrost biomarkera kaspazy-3 i 7, wskazuje to na fazę aresztu cyklu komórkowego i konieczne mogą być pomiary w dodat­kowych punktach czasowych.

Podsumowanie

Test ApoTox-Glot™ Triplex wykorzystuje dwie technologie do analizy istotnych parametrów biologicznych – żywotno­ści komórek, cytotoksyczności oraz apoptozy w tym samym dołku mikropłytki. Dane uzyskane za pomocą testów jed­noparametrowych mogą być niepełne lub błędnie interpre­towane ze względu na różny dla danego systemu przebieg złożonych procesów komórkowych. Test ApoTox-Glot™ jest przydatnym narzędziem predyktywnym pozwalają­cym zrozumieć zależności przyczynowo-skutkowe między stosowaniem substancji cytotoksycznej a mechanizmem śmierci komórek, co umożliwia na przykład trafniejszą identyfikację leków.

Agnieszka Dobrogowski, Marketing & Project Management Promega GMBH