Toksyczność to cecha związków chemicznych polegająca na powodowaniu zaburzeń funkcji lub śmierci komórek żywych, organów lub organizmów po dostaniu się w ich pobliże.Toksyczność to działanie niepożądane wynikające z reakcji chemicznych, fizykochemicznych pomiędzy związkiem chemicznym, który wniknął do ustroju, a układem biologicznym (DNA, enzymy). 

Badanie toksyczności jest koniecznym etapem badań przedklinicznych potencjalnego  środka terapeutycznego.

Wykonanie testów ADME-Tox gwarantuje zminimalizowanie ryzyka wprowadzenia do fazy badań klinicznych związków nieodpowiadających założeniom projektu terapeutycznego lub takich, które wywierają niekorzystny uboczny wpływ na funkcjonowanie komórki. 

Uzyskane na podstawie naszych testów dane mogą posłużyć do wyselekcjonowania związków o najbardziej korzystnych parametrach fizykochemicznych oraz kontroli i walidacji wyników uzyskanych na podstawie wcześniejszych badań.
 

• Analizy genotoksyczności

BioCentrum oferuje wykonanie jednego z głównych testów pozwalających na ocenę właściwości genotoksycznych (mutagennych), które stanowią istotny element podczas szacowania bezpieczeństwa stosowania potencjalnych substancji leczniczych. 

Test  Amesa - przeprowadzany jest zgodnie z wytycznymi OECD TG 471 i ma na celu zbadanie mutacji powrotnych w komórkach specyficznych szczepów bakteryjnych. 

Test opiera się na  wykrywaniu mutacji powrotnych w komórkach bakteryjnych i wykorzystuje szczepy mutantów pokarmowych Salmonella typhimurium, które nie mają zdolności do produkcji aminokwasów niezbędnych do wzrostu (np. L-histydyny). 
Bakterie, w których doszło do mutacji na skutek działania badanego związku chemicznego identyfikowane są na podstawie ich zdolności do wzrostu w pożywce pozbawionej L-histydyny.

 

Test Mutacji Genowych w komórkach ssaków:

Test mutacji genu kinazy tymidynowej na komórkach chłoniaka myszy (ang. Mouse Lymphoma Assay)

W teście na mutację kinazy tymidynowej w komórkach mysich stosowany jest ulokowany autosomalnie gen kinazy tymidynowej (TK), będący reporterem mutacji powstałych pod wpływem badanego związku. Umożliwia on detekcję szerokiego spektrum uszkodzeń genetycznych. 

Metoda polega na hodowaniu komórek w podłożach selekcjonujących, zawierających czynnik działający toksycznie na wszystkie komórki nie będące mutantami. TK umożliwia wbudowywanie tymidyny i jej toksycznych analogów ze źródeł egzogennych do komórki. Selekcję mutantów homo- i heterozygotycznych umożliwia dodanie trójfluorotymidyny (TFT) do medium hodowlanego. Zmutowane komórki mogą rozmnażać się w obecności TFT, w odróżnieniu od zwykłych komórek zawierających kinazę tymidynową. 
Pomiar mutacji kinazy tymidynowej (TK), polegający na zliczaniu dużych i małych kolonii komórek mutantów w medium selekcyjnym na płytce 96-dołkowej, umożliwia wykrycie różnego rodzaju zaburzeń genetycznych (np. aberracji chromosomowych lub mutacji punktowych).

Test mutacji genu kinazy tymidynowej wykonywany jest przy użyciu komórek chłoniaka myszy 
L5178Y Tk+/- (ang. Mouse T cell Lymphoma) zgodnie z wytycznymi Organizacji Współpracy Gospodarczej i Rozwoju (OECD) – „Guideline 476: In Vitro Mammalian Gene Mutation Test” oraz normy PN-EN ISO 10993-3:2008 „Biologiczna ocena wyrobów medycznych - Część 3: Badania genotoksyczności, rakotwórczości i toksycznego wpływu na rozrodczość”.

Test Mikrojąder (ang. Micronucleus Assay, MNA)

Analiza mikrojąder jest uznawana za użyteczny biomarker badania skutków narażenia organizmu na czynniki genotoksyczne. Mikrojądra pochodzą zarówno z fragmentów chromosomów jak i całych chromosomów nieprawidłowo rozdzielonych podczas podziału komórkowego. Złamania chromosomów i dysfunkcja aparatu mitotycznego komórek, przyczyniające się do powstawania mikrojąder, pozwalają na ocenę stopnia uszkodzeń chromosomów na poziomie pojedynczej komórki i analizę nieprawidłowości na poziomie cytogenetycznym. 

Test mikrojądrowy in vitro przeprowadzany jest zgodnie z wytycznymi Organizacji Współpracy Gospodarczej i Rozwoju (OECD)  - „Guideline 487: In Vitro Mammalian Cell Micronucleus Test” oraz normy PN-EN ISO 10993-3:2008 „Biologiczna ocena wyrobów medycznych - Część 3: Badania genotoksyczności, rakotwórczości i toksycznego wpływu na rozrodczość”. Analizy wykonywane są na linii komórkowej pochodzącej z jajnika chomika chińskiego CHO-K1 (ang. Chinese Hamster Ovary Cell Line),  wskazanej przez wytyczne OECD 487.

• Analizy cytotoksyczności

Badania cytotoksyczności cząsteczek potencjalnych leków na hodowle komórkowe in vitro stanowią doskonały wstęp ogólnie pojmowanych badań toksykologicznych, niezbędnych do określenia prawidłowego działania oraz bezpieczeństwa leku. W przypadku hodowli komórkowych badane substancje i ich prekursory lub metabolity dodawane są do medium 
w celu określenia ich działania na poziomie komórkowym, a często także molekularnym. Zastosowanie modeli komórkowych w badaniach toksykologicznych posiada ponadto wiele zalet, takich jak: szybkość i łatwość badania procesów komórkowych i molekularnych, powtarzalność, możliwość stosowania niewielkich ilości badanych substancji, czy możliwość pracy na komórkach ludzkich.

BioCentrum oferuje szeroki zakres badań cytotoksyczności w hodowlach komórkowych in vitro wykonywanych w standardach DPL (dobrej praktyki laboratoryjnej) oraz przy użyciu odpowiednich modeli komórkowych. Badania prowadzone w laboratorium komórkowym naszej firmy wykonywane są w zależności od potrzeb na hodowlach komórkowych pierwotnych, a także różnorakich liniach komórkowych zarówno ustalonych, jak i ciągłych (nieśmiertelnych, pochodzenia nowotworowego). 

Test MTT oraz MTS
Oba testy oparte są na zdolności enzymu dehydrogenazy mitochondrialnej do przekształcania pomarańczowej, rozpuszczalnej w wodzie soli tetrazolowej (MTT lub MTS) do formazanu będącego kolorowym produktem powyższej reakcji. W przypadku testu MTT produkt jest nierozpuszczalny w wodzie i wymaga rozpuszczenia w rozpuszczalnikach organicznych. Test MTS stanowi z kolei udoskonaloną wersję testu MTT, w której produkt reakcji konwersji soli tetrazolowej przez dehydrogenazę powstający w obecności PMS  (ang. phenazine methosulfate) jest w pełni rozpuszczalny w wodzie. Zdolność do produkcji formazanu mają tylko żywe komórki, co pozawala na szybkie i dokładne określenie procentu funkcjonalnych komórek oraz wpływu badanego czynnika na żywotność dowolnej linii komórkowej. Testy wykonywane są poprzez dodanie niewielkiej ilości reagentu bezpośrednio do hodowli komórkowych, inkubacji 1-4 godzin i pomiarze absorbancji za pomocą profesjonalnego wielofunkcyjnego czytnika płytek.

Test LDH
Test LDH podobnie do testów MTT oraz MTS jest testem kolorymetrycznym, polegającym na pomiarze absorbancji na skutek powstawania barwnego produktu reakcji enzymatycznej. Polega on na pomiarze ilości dehydrogenazy mleczanowej (ang. lactate dehydrogenase, LDH), wewnątrzkomórkowego enzymu cytoplazmatycznego, uwalnianego z komórki do medium hodowlanego na skutek jej lizy. Badanie polega na określeniu ilości LDH uwolnionej z martwych komórek poprzez pomiar reakcji enzymatycznej konwersji soli tetrazolowej do barwnego formazanu w nadsączach znad komórek inkubowanych z badanym czynnikiem.

Test BrdU
Test powyższy jest kolejnym standardowym testem używanym w badaniach toksykologicznych in vitro. Polega on na ilościowym pomiarze syntezy DNA, a więc proliferacji komórek. Bromodeoksyurydyna (ang. bromodeoxyuridine, BrdU) jest syntetycznym analogiem nukleozydu tymidyny inkorporowanym do DNA w dzielącej się komórce w trakcie fazy S podziału komórki. Detekcja BrdU za pomocą specyficznego przeciwciała sprzężonego z enzymem oraz reakcja enzymatyczna powyższego enzymu 
z chromogennym substratem pozwala na kolorymetryczną analizę zdolności proliferacyjnych komórek. Pozytywny wynik BrdU świadczy o żywotności i funkcjonalności danej linii komórkowej. Obecnie test BrdU stosowany jest w badaniach takich jak: oznaczanie proliferacji komórek indukowanej czynnikami wzrostowymi, innymi cytokinami, a także badanymi cząsteczkami chemicznymi, analiza immunoreaktywności limfocytów pod wpływem stymulacji miogenami i antygenami, czy wrażliwości komórek nowotworowych na leki cytostatyczne.

• Analiza zmian apoptotycznych i nekrotycznych oraz zatrzymania cyklu komórkowego

W celu oceny wpływu badanych związków na funkcjonowanie komórek, BioCentrum oferuje przeprowadzenie dwóch testów wykonywanych metodą cytometrii przepływowej. Są nimi identyfikacja zmian apoptotycznych i nekrotycznych w hodowli wybranej linii komórkowej oraz ocena zmian przebiegu cyklu komórkowego spowodowanych działaniem badanej substancji.

Analiza zmian apoptotycznych i nekrotycznych za pomoca cytometrii przepływowej (barwienie AnxV/PI)
Apoptoza jest fizjologicznym procesem zaprogramowanej śmierci komórkowej, która jest niezbędna podczas rozwoju zarodkowego i utrzymaniu homeostazy tkanek. Nowe leki powiązane ze zjawiskiem apoptozy mają być najskuteczniejszym rozwiązaniem w walce z nowotworami cechującymi się wysokimi wskaźnikami proliferacji i są obecnie wyłaniane w kierunku zastosowania w terapii przeciwnowotworowej. Najlepiej poznanym markerem powierzchniowym komórek apoptotycznych jest fosfatydyloseryna (PS). Ekspozycja PC na powierzchni umierających komórek pozwala na bezpieczną i efektywną eliminację pozostałości poapoptotycznych, co zapobiega indukcji stanu zapalnego. BioCentrum oferuje wysokiej czułości, precyzyjne metody identyfikacji śmierci komórkowej z użyciem wyznakowanej fluorescencyjnie aneksyny V (AnxV) która specyficznie i z wysokim powinowactwem wiąże się do PS. Dodatkowe zastosowanie jodku propidyny (PI) i profesjonalnej techniki analizy cytometrii przepływowej pozwala na niezawodne scharakteryzowanie i rozróżnienie typu śmierci komórkowej (apoptotycznej lub nekrotycznej). Analiza apoptozy / nekrozy wraz z identyfikacją zatrzymania cyklu komórkowego, stanowią doskonałe uzupełnienie badań cytotoksyczności.

Analiza zatrzymania cyklu komórkowego za pomoca cytometrii przepływowej (barwienie PI)
Badania nad charakterystyką proliferacji komórek prawidłowych i nowotworowych dostarczają szerokiego źródła informacji na temat molekularnych mechanizmów leżących u podstaw replikacji komórek, pozwalają na zrozumienie mechanizmów działania leków i projektowanie efektywnej strategii terapii przeciwnowotworowej. Zatrzymanie cyklu komórkowego jest zjawiskiem odgrywającym kluczową rolę w terapii raka, AIDS i chorób sercowo-naczyniowych. Wiele naturalnie występujących i zsyntetyzowanych związków uznanych za potencjalne leki przeciwnowotworowe wpływa na podstawowe mechanizmy kontroli cyklu komórkowego i moduluje jego etapy dzięki czemu może potencjalnie służyć w terapii i prewencji przeciwnowotworowej. Analiza zatrzymania cyklu komórkowego podobnie jak identyfikacja apoptozy i oznaczenie cytotoksyczności stają się podstawowymi metodami stosowanymi w badaniach nad rozwojem nowoczesnych leków przeciwnowotworowych. Najpowszechniej stosowanym barwnikiem do znakowania wewnątrzkomórkowego DNA i analizy cyklu komórkowego jest jodek propidyny (PI) który jest zdolny do interkalowania się wewnątrz struktury dwuniciowego DNA i formowania silnie fluorescencyjnego adduktu. Metoda polega na wybarwieniu przy użyciu PI utrwalonych i traktowanych rybonukleazą komórek, a następnie ich cytometrycznej analizie, której celem jest określenie liczby komórek pozostających w jednej z trzech faz cyklu (G0/G1, S oraz G2/M).