Mikroskopia korelacyjna to pomost między dwiema, pozornie niemającymi ze sobą wiele wspólnego, technikami obserwacyjnymi: fluorescencyjną mikroskopią świetlną oraz skaningową mikroskopią elektronową. Połączenie tych dwóch metod umożliwia wykorzystanie zalet obu: fluorescencyjna mikroskopia pozwala na akwizycję obrazów w szerokim polu całych struktur komórkowych, skaningowa mikroskopia elektronowa umożliwia natomiast wniknięcie, z dużo większą rozdzielczością, w poszczególne struktury w komórce – aż do poziomu molekularnego włącznie.

Co więcej, mikroskopia korelacyjna, z uwagi na naturę dwóch wymienionych technik, dostarcza równoczesnej informacji o funkcji oraz strukturze obserwowanej próbki. Możliwość znacznikowania wieloma barwnikami fluorescencyjnymi interesujących struktur wraz ze wsparciem wysokorozdzielczego obrazowania elektronowego tłumaczy gwałtownie wzrastające zainteresowanie środowisk naukowych mikroskopią korelacyjną. Podwójna analiza tych samych obszarów daje badaczom komplementarne i często unikalne informacje o badanych obiektach.

Delphi – mikroskop korelacyjny w zwartej formie
Nowoczesną formą realizacji urządzenia wykorzystującego zalety mikroskopii korelacyjnej jest mikroskop Delphi – efekt współpracy producenta skaningowych mikroskopów elektronowych – firmy Phenom World – oraz producenta modułów fluorescencyjnych do mikroskopii SEM – firmy Delmic.

Jako urządzenie nabiurkowe mikroskop korelacyjny Delphi jest ekstremalnie skutecznym i jednocześnie prostym w obsłudze narzędziem, obrazującym struktury komórkowe. Jego skuteczność wsparta jest unikalną procedurą nakładania obrazu świetlnego i elektronowego z tego samego obszaru próbki. Dzięki zastosowanej procedurze, użytkownik ma pewność obserwacji w obu trybach zawsze tego samego fragmentu próbki, przy czym ma również możliwość przełączania bieżącej obserwacji
w tryb fluorescencyjny lub elektronowy.

Konstrukcja mikroskopu Delphi opiera się o nabiurkowy skaningowy mikroskop elektronowy Phenom firmy Phenom World – w górnej części oraz mikroskop odwrócony fluorescencyjny, zaprojektowany w firmie Delmic – w części dolnej. Rewolucyjna konstrukcja mikroskopu Delphi została doceniona przez ekspertów czasopisma „Microscopy Today” nagrodą roku 2015 za innowacyjność.

Dzięki swojej unikalnej konstrukcji Delphi daje użytkownikom możliwość odkrywania i łączenia informacji o ultrastrukturze (zdolność rozdzielcza w trybie elektronowym leży poniżej 10 nm, powiększenie do 130 000X) oraz kontekście zawartym w obrazie fluorescencyjnym. Zastosowanie znacznikowania fluorescencyjnego ułatwia odnalezienie interesujących struktur (mikroskopia fluorescencyjna), a w kolejnym etapie zlokalizowany obszar można zobrazować wysokorozdzielczo (mikroskopia elektronowa). Fluorescencyjny tryb pracy mikroskopu Delphi oferuje oświetlenie LED ze wzbudzeniem w czterech pasmach: 392 nm, 474 nm, 554 nm oraz 635 nm. Zastosowane filtry widmowe umożliwiają prowadzenie obserwacji w bardzo szerokim zakresie stosowanych barwników fluorescencyjnych (np. DAPI, FITC, TRITC, Cy5).

SECOM – moduł detekcji fluorescencji do mikroskopu SEM
Stworzony w firmie Delmic moduł SECOM do korelacyjnej detekcji sygnału świetlnego w mikroskopie elektronowym może zostać zintegrowany w większości mikroskopów SEM. SECOM instalowany jest w miejscu drzwi do komory skaningowego mikroskopu elektronowego. Próbka znajduję się w zmotoryzowanym stoliku, który od dołu sprzężony jest z mikroskopem fluorescencyjnym, natomiast od góry umożliwia badanie preparatu wiązką elektronową. Doposażenie istniejącego wysokorozdzielczego mikroskopu elektronowego o detekcję sygnałów z markerów fluorescencyjnych, pozwala na znajdowanie regionów zainteresowania oraz badanie procesów komórkowych na ultrastrukturalnym obrazie elektronowym.

W platformie SECOM do detekcji obrazu świetlnego użyte są najwyższej jakości komponenty optyczne wraz z wysoką aperturą numeryczną, dzięki czemu nie zachodzi potrzeba korzystania z innego, dodatkowego mikroskopu optycznego. Istnieje ponadto możliwość wyposażenia modułu w optykę super rozdzielczą – diametralnie zwiększającą możliwości wysokorozdzielczego obrazowania w kontraście fluorescencji. Dzięki zastosowaniu opatentowanej techniki markerów katodoluminescencyjnych, użytkownik otrzymuje obrazy z obu mikroskopów, skorelowane z rozdzielczością lepszą niż 50 nm. Korelacja wykonywana jest automatycznie i bez potrzeby ingerencji operatora, co zapewnia powtarzalne i rzetelne pomiary próbek biologicznych. Wraz z modułem SECOM dostarczane jest zintegrowane oprogramowanie ODEMIS, dające użytkownikowi możliwość sterowania, zarówno mikroskopem fluorescencyjnym, jak i elektronowym. Przyjazny interfejs oprogramowania, auto-focus, a także historia oglądanych obszarów pozwalają badaczowi z łatwością wykorzystać olbrzymi potencjał korelacji obu technik badawczych.

Zobaczyć więcej
Obydwa rozwiązania otwierają nowy rozdział w dziedzinie badań mikroskopowych preparatów biologicznych. Precyzyjne skorelowanie obrazów – będących pochodną dwóch technik obrazowania – otwiera niedostępne do tej pory możliwości interpretacji procesów zachodzących w ultrastrukturze badanego preparatu. Najistotniejsze jest to, że badamy w obu przypadkach dokładnie ten sam preparat. Co więcej, nie musimy przenosić go pomiędzy różnymi platformami do obrazowania – korzystamy ze zintegrowanego układu do obrazowania, zarówno z użyciem skanowania wiązką elektronową, jak też w kontraście fluorescencji. Ogranicza to ryzyko wprowadzenia artefaktów do wyników naszych badań. Gwarantuje natomiast maksymalną, możliwą dokładność połączenia wyników wymienionych powyżej obu badań mikroskopowych.

Autorzy:

Konrad Szczecina, Sales Product Manager,
PIK Instruments
dr Marcin Jedyński, Senior Sales Product Manager, PIK nstruments
http://pik-instruments.pl/