Dwie technologie

Zarówno w RNA-Seq jak i w przypadku mikromacierzy ekspresyjnych, RNA konwertowany jest do cDNA (i dalej do cRNA w przypadku mikromacierzy). W technologii RNA-Seq fragmenty cDNA są sekwencjonowane poprzez odczyty o długości od 30 do 400 par zasad. Liczba odczytów na próbkę zależy od projektu doświadczenia i jest wypadkową przepustowości posiadanej platformy sprzętowej, liczebności badanych grup, pożądanej głębokości sekwencjonowania i budżetu projektu. Odczyty te są następnie mapowane względem próby referencyjnej, bądź składane de novo w celu identyfikacji i zliczenia poszczególnych transkryptów.

Technika mikromacierzywykorzystuje hybrydyzację wyznakowanego cRNA do sond oligonukleotydowych, umieszczonych w dużym zagęszczeniu na macierzy. Obecna technologia umożliwia umieszczenie na slajdzie od dziesiątków przez setki tysięcy, aż do kilku milionów sond mogących reprezentować wszystkie geny opisane w badanym genomie.

A więc RNA-Seq?

Wraz z pojawieniem się na rynku technologii RNA-Seq wielu wróżyło koniec ery mikromacierzy ekspresyjnych. Dzięki wykorzystaniu RNA-Seq można zarówno badać znane, jak i odkrywać nowe transkrypty. Użytkownik może zdecydować się na sekwencjonowanie tylko konkretnych obszarów transkryptomu. Mówimy wtedy o ukierunkowanym RNA-Seq. Rozwiązanie SureSelect firmy Agilent Technologies umożliwia dowolne zaprojektowanie sond RNA, które wychwycą z próbki tylko konkretne fragmenty przygotowanej biblioteki cDNA. Dzięki temu możliwe jest obniżenie kosztu eksperymentu i skupienie się na analizie tylko tych wyników, które interesują badacza.Zawartość mikromacierzy ogranicza się do informacji obecnych w bazach danych w momencie jej produkcji, podczas gdy wyniki uzyskane z RNA-Seq mogą być aktualizowane, gdy publikowane są nowe informacje o badanym genomie.Dzięki jednoznacznemu mapowaniu sekwencji względem unikatowych regionów genomu, RNA-Seq charakteryzuje się także niskim sygnałem tła.Dodatkową zaletą sekwencjonowania następnej generacji jest możliwość analizy wyłącznie wybranych fragmentów genomu. Dzięki takiemu podejściu możliwe jest zwiększenie głębokości sekwencjonowania w interesujących badacza obszarach, pozwalające na wykrycie np. fuzji genowych powstałych po ligacji dwóch intronów lub identyfikację nowych transkryptów o niskiej i krótkiej ekspresji, niemożliwej do wykrycia przy konwencjonalnym podejściu do sekwencjonowania genomu.

Czy może jednak mikromacierze?

W badaniach ekspresji genów mikromacierze wciąż jednak są techniką tańszą od RNA-Seq. Najlepsze technologie mikromacierzowe na rynku charakteryzują się zakresem dynamicznymsygnału ponad 5-log. Parametr ten posiada rozkład normalny ijest monitorowany w każdym eksperymencie przy pomocy wewnętrznych punktów kontrolnych. W technice RNA-Seq podobny zakres dynamiczny jest możliwy do uzyskania jedynie przy bardzo dużej ilości sekwencjonowania przydzielonej na próbę, co znacznie podwyższa koszty doświadczenia. Ponadto czynnikami zwiększającymi cenę eksperymentu są konieczność stosowania nowych i kosztownych urządzeń oraz rozbudowanej analizy bioinformatycznej. W przypadku platformy mikromacierzowej firmy AgilentTechnologies (reprezentowanej w Polsce przez Perlan Technologies Polska Sp. z o.o.)wysoki zakres dynamiczny jest pochodną najwyższej możliwej jakości wszystkich jej komponentów (od oligonukleotydów na mikromacierzy do skanera i oprogramowania), zastosowania technologii wzmocnienia detekcji sygnału ‘eXtendedDynamicRange’ oraz sprawdzonych algorytmów usuwania szumu i szacowania realnych wartości stosunku sygnału tła do sygnału generowanego przez sondy odpowiadające genom o najniższej ekspresji. Nowoczesne metody mikromacierzowe, w których wykorzystuje się sondy hybrydyzujące z poszczególnymi egzonami, umożliwiają także badania alternatywnego składania genów.W ofercie wiodących producentów mikromacierzy znajdują się także takie z sondami do wykrywania długich niekodujących RNA (lincRNA), a badanie miRNA z wykorzystaniem mikromacierzy jest już standardem. Analiza danych z eksperymentów mikromacierzowych jest obecnie w znacznej mierze wystandaryzowana i uproszczona. Dzięki możliwości wykorzystania coraz doskonalszych i coraz łatwiejszych w obsłudze platform do analizy danych (np. program Genespring GX), analiza taka może być wykonana przez biologa nie posiadającego dużej wiedzy z zakresu bioinformatyki i statystyki.Wspomniany program Genespring GX umożliwia jednoczesną analizę wyników z mikromacierzy ekspresyjnych, mikromacierzy dedykowanych do alternatywnego splicingu oraz mikromacierzy do profilowania mikroRNA. Możliwości analizy nie ograniczają naukowca do badania prób RNA w obrębie jednego gatunku. Jedna analiza może bowiem obejmować RNA pochodzący np. od człowieka, myszy i szczura.Ponieważeksperymentator wie jakie zjawiska stoją za analizowanymi liczbami, najważniejsza część analizy danych – nadanie im biologicznego kontekstu, jest znacznie ułatwiona. W przypadku analiz danych z RNA-Seq, wciąż nie ma opracowanych standardowych protokołów. Wielkość plików z danymi z takich analiz zwykle jest około kilkudziesięciokrotnie większa od plików z danymi z eksperymentu mikromacierzowego. Aby skutecznie przeanalizować tak ogromną ilość danych, poza rozległymi umiejętnościami bioinformatycznymi, trzeba dysponować znacznymi zasobami komputerowymi, szczególnie w aspekcie mocy obliczeniowej, pamięci podręcznej oraz magazynu danych.

Są różne odcienie szarości

Wydaje się, że konsensusem w tej dyskusji jest potraktowanie obu technik nie jako konkurujących, ale jako wzajemnie się uzupełniających. Efektywne, specyficzne i precyzyjne ilościowe oznaczenia ekspresji genów na mikromacierzachmogą dopełnić możliwość odkrywania i identyfikacji nowych lub alternatywnych transkryptów z wykorzystaniem RNA-Seq.

Na potrzeby szybkich i prostych eksperymentów, mikromacierze mogą zapewnić wysokiej jakości, dokładne wyniki. Z dobrymi opisami sond, możliwością zaprojektowania sond wykrywających niekodujące RNA (np.miRNAlublincRNA), technika mikromacierzowamoże oferować funkcjonalność zbliżoną do RNA-Seq przy wciąż niższych kosztach i znacznie krótszym czasie od eksperymentu do uzyskania wyniku.

Z drugiej strony, koszt i trudność wykonania analiz z wykorzystaniem RNA-Seq będzie się obniżać, zwiększając dostępność i atrakcyjność tej metody. Niezwykle interesujące są też zmiany związane z metodami sekwencjonowania trzeciej generacji. Ze zdecydowanie niższym odsetkiem błędów (wynikającym z braku zastosowania enzymów i brakiem amplifikacji) oraz możliwością zwiększenia głębokości sekwencjonowania, metody tew przyszłości z pewnością ustalą nowy standard w badaniach ekspresji genów.

Podsumowując, znajomość możliwości i ograniczeń każdej z technik analizy transkryptomuoraz precyzyjne sformułowanie celów badawczych są dziś konieczne do wybrania odpowiedniej techniki, która będzie mogła zapewnić najlepsze rezultaty przy optymalnych kosztach eksperymentu.

Rozwiązania

Firma Agilent Technologiesoferuje najwyższej jakości rozwiązania zarówno do przygotowywania bibliotek do ukierunkowania RNA-Seq, jak i kompleksowej analizy z wykorzystaniem mikromacierzy ekspresyjnych. Agilent opracował oprogramowanie do analizy danych z eksperymentów wysokoprzepustowych (Strand NGS oraz GeneSpring), które może być połączone w potężną platformę do jednoczesnej analizy danych genomicznych, proteomicznych i metabolomicznych, oferując realną i unikalną możliwość wejścia ze swoimi badaniami w świat „multi-omiki”.

dr Bartosz Wojciechowicz, Perlan Technologies Polska Sp. z o.o.