Nanolive SA to start-up powstały w 2013 roku w EPFL Innovation Park w Lozannie. Technologia firmy rozwija pracę doktorską dr Yann Cotte (CEO) z Laboratorium Mikrosystemów EPFL, której wyniki zostały opublikowane w "Nature Photonics" w 2013 roku. Opracowana przez Nanolive technika holograficznej mikroskopii tomograficznej pozwala uzyskać trójwymiarowy obraz struktury wewnętrznej materiałów biologicznych, z rozdzielczością znacząco przekraczającą granicę dyfrakcji. Holotomografia obrazuje zmiany propagacji światła w materiale, dzięki czemu otrzymujemy trójwymiarową matrycę dystrybucji współczynnika załamania światła (RI) w badanym materiale. Pozwala to na, nieosiągalne do tej pory, bezinwazyjne obrazowanie wnętrza żywych komórek, bez ich utrwalania, uszkadzania lub modyfikacji chemicznej.

Jak działa technika holotomografii?

Podstawą działania Nanolive jest połączenie algorytmów holograficznych ze skanowaniem rotacyjnym (tomografia). Próbka zostaje umieszczona nad obiektywem o wysokiej aperturze numerycznej NA, a poniżej obrotowego ramienia mikroskopu. Światło z zielonej (520 nm) diody laserowej zostaje rozdzielone we wnętrzu mikroskopu na dwie linie: pomiarową oraz referencyjną. Próbka zostaje oświetlona światłem lasera pod kątem 45° z pomocą ramienia oświetlającego, które następnie obraca się w zakresie 360° wokół badanego materiału. Dla kolejnych ustawień kątowych ramienia nagrywana jest z pomocą kamery cyfrowej seria hologramów, które powstają poprzez nałożenie na siebie linii pomiarowej i referencyjnej lasera. Obrazy holograficzne to surowe dane, które zostają następnie przetworzone przez unikalne algorytmy dekonwolucji Nanolive. Obrobione dane zostają przedstawione użytkownikowi jako “Z-stack” 96 monochromatycznych obrazów. Cały proces akwizycji i rekonstrukcji zajmuje dwie sekundy. Otrzymane obrazy zapewniają badaczowi wysoką rozdzielczość i doskonały kontrast, które normalnie wymagałyby ekstremalnie skomplikowanych i drogich układów optycznych.

Cyfrowe barwienie D-Stain badanych materiałów

Intuicyjne oprogramowanie STEVE pozwala na bezinwazyjne, cyfrowe barwienie badanych materiałów. Podczas pomiaru Nanolive tworzona jest trójwymiarowa matryca rozkładu współczynników załamania światła (RI) w próbce, która domyślnie wyświetlana jest jako „Z-Stack”. Na potrzeby dalszej wizualizacji i analizy interesujących nas regionów możliwe jest stworzenie cyfrowego wybarwienia bazującego na liczbowym, a nie chemicznym markerze. Oprogramowanie STEVE pozwala na wyznaczenie kolorystyczne regionów o podobnym zakresie wartości i gradientu współczynnika załamania światła (różne organelle mają różne właściwości optyczne). Cały proces jest szybki i intuicyjny, a wyznaczone wybarwienia dają nam ilościową informację o zakresie i średniej wartości współczynnika załamania światła oraz objętości wybarwionego obszaru.

Doskonałym przykładem zastosowania cyfrowego barwienia D-Stain jest obrazowanie cytotoksyczności. Na poniższym obrazie została przedstawiona internalizacja cząstek nanodiamentów (ciemne plamy) w komórkach wątroby. Pomiary te zostały wykonane na systemie Nanolive 3D Cell Explorer przez doktora Wojciecha Chrzanowskiego z Wydziału Farmacji, na Uniwersytecie w Sydney.

Możliwości obrazowania przyżyciowego time-lapse

Technika holotomografii Nanolive daje nam możliwość nieinwazyjnego obrazowania 3D z dużą szybkością 0,5 klatki na sekundę. Naturalną drogą rozwoju było wyposażenie mikroskopu 3D Cell Explorer w zintegrowany inkubator typu „table-top”. Montowany na stoliku pomiarowym miniaturowy inkubator zapewnia nam kontrolę wilgotności, temperatury oraz stężenia CO2. Zarówno konstrukcja mikroskopu, jak i inkubatora zoptymalizowane zostały pod kątem wielogodzinnych, a nawet kilkudniowych pomiarów „time-lapse”. Możliwości obrazowania przyżyciowego najlepiej pokazuje kompilacja wyników „time-lapse” uzyskanych przez użytkowników 3D Cell Explorer.

Mikroskopia korelacyjna, połączenie holotomografii z fluorescencją

Najnowsza generacja mikroskopów Nanolive 3D Cell Explorer-fluo zapewnia naukowcom połączenie obrazowania strukturalnego holotomografii 3D z uznaną i ustandaryzowaną metodą mikroskopii fluorescencyjnej 2D. Korelacja tych dwóch technik otwiera zupełnie nowe możliwości badawcze. Podczas jednego pomiaru możliwe jest równoczesne wyznaczenie dziesięciu różnych markerów, siedmiu cyfrowych oraz trzech markerów fluorescencyjnych. Pozwala to na przekształcenie dwuwymiarowej informacji fluorescencyjnej w trójwymiarową informację strukturalną. Nanolive 3D Cell Explorer-fluo daje nam łatwy dostęp do wyników niedostępnych innymi technikami, szczególnie w przypadku organelli, które nie mogą być w prosty sposób wybarwione fluorescencyjnie.

Nanolive 3D Cell Explorer oraz 3D Cell Explorer-fluo to prawdziwa rewolucja w badaniach żywych materiałów biologicznych. Pozwalają one na bezinwazyjne obrazowanie wnętrza komórek, z nanometryczną rozdzielczością (200 nm XY, 500 nm Z) z prędkością 0,5 klatki na sekundę. Zdolności pomiarowe w parze z inteligentnym i intuicyjnym oprogramowaniem STEVE otwierają zupełnie nowe możliwości badania interakcji, cytotoksyczności, podziałów i śmierci komórek, całkowicie zmieniając nasze podejście do mikroskopii.