Fot. Chromatogram z wynikiem rozdziału barwników atramentu leżący na walcowatej komorze chromatograficznej. Linia startu znajduje się po lewej stronie.

Znaczenie chromatografii cienkowarstwowej w analizie chemicznej

Chromatografia cienkowarstwowa (z ang. thin-layer chromatography, TLC) jest techniką umożliwiającą jednoczesną analizę wielu próbek, w najkrótszym możliwym czasie. Na popularności coraz bardziej zyskuje zaawansowana odmiana TLC – wysokosprawna chromatografia cienkowarstwowa (z ang. high-perfomance thin-layer chromatography, HPTLC). W odróżnieniu od klasycznej TLC, w technice HPTLC stosowane są m.in. adsorbenty o znacznie mniejszych wielkościach ziaren czy objętości próbki rzędu ułamków mikrolitra. Dzięki temu uzyskuje się zadowalający rozdział składników w znacznie krótszym czasie i dla niższej granicy wykrywalności.

Chromatografia cienkowarstwowa jest cennym uzupełnieniem wielu metod analizy, często droższych i trudniejszych do wykonania, jak chociażby połączenie wysokosprawnej chromatografii cieczowej ze spektrometrią mas. Taka sytuacja ma miejsce np. w przypadku analizowania dużej grupy związków, jakimi są kannabinoidy tłuszczowe, będące ważnymi składnikami biologicznie czynnymi. Ich efektywne rozdzielenie umożliwia prowadzenie dalszych badań dotyczących właściwości tych związków oraz ich potencjalnych zastosowań w farmacji i medycynie. Innym, bardzo istotnym zastosowaniem TLC, jest wykorzystanie tej techniki do oceny jakości, zafałszowania i autentyczności żywności, napojów i suplementów diety. Materiał badawczy w takich analizach obejmuje m.in. tłuszcze zwierzęce, oleje, przyprawy, soki czy herbatę – zatem są to niezwykle wymagające matryce do badań, gdzie chromatografia cienkowarstwowa ponownie stanowi ważne uzupełnienie innych metod analitycznych.

Densytometria jako sposób wizualizacji chromatogramów w TLC

Proces rozdziału analitów na adsorbentach w chromatografii cienkowarstwowej prowadzi do uzyskania chromatogramów w postaci plamek na płytkach chromatograficznych. Takie rozwiązanie niesie za sobą pewne niedogodności. Przede wszystkim kłopotliwe staje się dłuższe przechowywanie chromatogramów płytkowych – plamki rozdzielonych składników blakną i z czasem stają się nieczytelne lub dochodzi do uszkodzeń mechanicznych warstw adsorbentów na płytkach. Z punktu widzenia analizy chemicznej najkorzystniejsze są chromatogramy pikowe, które uzyskuje się chociażby w chromatografii cieczowej, kolumnowej. W przypadku TLC jest to możliwe, dzięki zastosowaniu urządzeń, nazywanych densytometrami. W ten sposób otrzymuje się chromatogramy densytometryczne, zwane densytogramami.

Densytometria jest jedną z metod wykorzystywanych do detekcji rozdzielanych analitów. Zastosowanie tego rodzaju obrazowania pozwala uzyskać densytogramy substancji widocznych w świetle widzialnym, absorbujących promieniowe nadfioletowe, a także tych, które fluoryzują w wyniku naświetlenia światłem nadfioletowym. Rozdzielanie analitów na płytkach w TLC finalnie dostarcza chromatogramu plamkowego, gdzie każda plamka odpowiada określonej substancji, która pierwotnie wchodziła w skład badanej mieszaniny. Densytometry przekształcają ten sam chromatogram plamkowy w chromatogram składający się z pików. Na takim chromatogramie każdy z pików reprezentuje inny składnik. Analizując czas, w którym następuje maksimum danego piku (czas retencji), można dokonać analizy jakościowej (czasy retencji są charakterystyczne dla danych substancji, w określonych warunkach rozdzielania). Natomiast analiza ilościowa (określenie, ile badanej substancji jest w analizowanym materiale) odbywa się poprzez wyznaczenie pól powierzchni pików na densytogramie i porównanie ich z właściwymi substancjami wzorcowymi.

Zasada działania densytometrów

Działanie densytometru opiera się na oddziaływaniu światła padającego wzdłuż linii rozwijania chromatogramu na poruszającą się płytkę. Padające światło jest absorbowane w różny sposób, w zależności od tego, czy pada na adsorbent (stanowiący podłoże płytki chromatograficznej), czy na plamkę rozdzielonego składnika. W związku z tym densytometry dokonują pomiaru światła odbitego, o różnej intensywności (w zależności od miejsca padania). Należy pamiętać, że mając do czynienia z płytkami wykonanymi ze szkła lub tworzywa sztucznego, równie dobrze można z wykorzystaniem densytometru mierzyć stopień intensywności światła, które przechodzi przez materiał płytki chromatograficznej. Zatem chromatogram pikowy w densytometrii powstaje po zarejestrowaniu przez fotodiody zmian intensywności światła odbitego lub przechodzącego przez płytkę chromatograficzną. Sygnały te są przekształcane na sygnały elektryczne i zapisywane w postaci pików.

Poddając analizie densytometrycznej próbkę, należy pamiętać, że:

* długość fali światła wykorzystywanego do detekcji analitu jest odpowiednio dobierana do rodzaju analizowanej substancji,

* skanowanie chromatogramów plamkowych odbywa się światłem monochromatycznym o określonej długości fali (selektywność spektralna),

* dopuszczalne jest wielokrotne przekształcanie chromatogramów plamkowych w densytogramy, stosując zmienne warunki detekcji, np. używając światła o różnej długości fali (optymalizacja jakości densytogramu).