Abstrakt:

„Metody alternatywne to metody spełniające wszystkie lub którąkolwiek z zasad 3R zaproponowanych przez Russella i Burcha w 1959:

Replacement – zastąpienie zwierząt w eksperymencie przez modele badawcze „nie odczuwające cierpień”,
Reduction – zmniejszenie liczby zwierząt, na których trzeba przeprowadzić badania,
Refinement – doskonalenie metod w kierunku zmniejszenia cierpień zwierząt w eksperymencie.

Zatem, metody alternatywne to nie tylko metody in vitro lecz także ulepszone, zmodyfikowane metody in vivo. Zapotrzebowanie na metody alternatywne jest ogromne zwłaszcza, że (…).”

Metody alternatywne to metody spełniające wszystkie lub którąkolwiek z zasad 3R zaproponowanych przez Russella i Burcha w 1959:
Replacement  – zastąpienie  zwierząt  w  eksperymencie  przez modele badawcze „nie odczuwające cierpień”,
Reduction – zmniejszenie  liczby  zwierząt,  na  których  trzeba przeprowadzić badania,
Refinement – doskonalenie  metod  w  kierunku  zmniejszenia cierpień zwierząt w eksperymencie.
Zatem, metody alternatywne to nie tylko metody in vitro lecz także ulepszone, zmodyfikowane metody in vivo.
Zapotrzebowanie na metody alternatywne jest ogromne zwłaszcza, że wg obowiązującego prawa m.in. Dyrektywa 2003/15/EC (7 poprawka do Dyrektywy Unii Europejskiej o Produktach Kosmetycznych 76/768/EEC) obowiązują lub wkrótce będą obowiązywać następujące zakazy:
od września 2004:
-    zakaz  testowania na zwierzętach końcowych produktów kosmetycznych, ale nie składników,
-    zakaz  testowania  na  zwierzętach  składników  lub  ich  kombinacji natychmiast  po  zaadoptowaniu  zwalidowanej przez  ECVAM metody  do Załącznika V Dyrektywy 67/548/EC
od marca 2009:
-    zakaz  obrotu  produktami  kosmetycznymi,  których  końcowy  produkt, składniki  lub  ich kombinacje były  testowane za zwierzętach za wyjątkiem badania: toksykokinetyki, toksyczności dawki powtarzanej (przewlekłej/podprzewlekłej), toksycznego działania na rozrodczość,
od marca 2013:
-    zakaz  oceny  toksyczności  substancji  chemicznych  na  zwierzętach  pod warunkiem, że będą dostępne odpowiednie metody alternatywne.
Chociaż zapotrzebowanie na metody alternatywne jest ogromne, to jednak trzeba pamiętać że proces rozwoju, walidacji i implementacji do ustawodawstwa nowej metody alternatywnej jest długi: 6-8 lat.

Najważniejszym źródłem informacji o metodach alternatywnych jest Europejskie Centrum Walidacji Metod Alternatywnych (ECVAM, European Centre for the Validation of Alternative Methods) - organizacja powołana w 1992 r. przez Komisję Europejską, której zadaniem jest:
- walidacja metod alternatywnych na terenie Unii Europejskiej,
- stworzenie  lokalnego  punktu  wymiany  informacji  na  temat  rozwoju metod alternatywnych,
- zorganizowanie  i  kierowanie  bazą danych  na  temat  metod alternatywnych,
- popieranie  dialogu  między  ustawodawcami,  przemysłowcami, organizacjami  konsumentów  i  grupami  mającymi  na  celu  ochronę zwierząt.
Na stronie ECVAM (http://ecvam.jrc.it/) można znaleźć m.in. raporty ze specjalistycznych warsztatów ECVAM, wykaz i opis metod zwalidowanych przez ECVAM Scientific Advisory Committee (ESAC). ECVAM zorganizował również bazę danych ECVAM DataBase Service on ALternative Methods (DB-ALM) http://ecvam-dbalm.jrc.ec.europa.eu/, gdzie bezpłatnie, po zalogowaniu można uzyskać dostęp do protokołów INVITTOX – aktualne,  dokładne,  techniczne  informacje  dotyczące wykonywania technik in vitro, ich zastosowania, zalet i wad. Każdy  protokół stworzony  przez  INVITTOX  zawiera  szczegółową metodykę umożliwiającą innym  badaczom  wykonanie  procedury, dane  techniczne pozwalające na  dokonanie  racjonalnego wyboru techniki i obserwowanych efektów końcowych.

Dostępne metody alternatywne można pogrupować następująco:
Metody alternatywne dostępne w UE dla celów regulacyjnych – zawarte w Części B Aneksu V do Dyrektywy 67/548/EEC:
>> Metody oceny toksyczności ostrej
- B.1.BIS. Toksyczność ostra (podanie drogą pokarmową). Metoda Ustalonej Dawki
- B.1.TRIS. Toksyczność ostra (podanie drogą pokarmową). Metoda Klas Ostrej Toksyczności
>> Metody oceny genotoksyczności/mutagenności
Ocena mutacji genowych (punktowych):
- B.13/14. Test mutacji powrotnych na bakteriach
- B.15. Test mutacji genowych na komórkach Saccharomyces cerevisiae
- B.17. Test mutacji genowych na komórkach ssaków in vitro
- B.20. Badanie recesywnych mutacji letalnych związanych z płcią na Drosophila melanogaster
- B.24. Test plamkowy na myszach (mutacje komórek somatycznych in vivo)
Ocena aberracji chromosomowych:
- B.10. Test aberracji chromosomowych na komórkach ssaków in vitro
- B.11. Test aberracji chromosomowych na szpiku kostnym ssaków in vivo
- B.12. Test mikrojądrowy na erytrocytach ssaków in vivo
- B.22. Badanie dominujących mutacji letalnych na gryzoniach
- B.23. Badanie aberracji chromosomowych na spermatogoniach ssaków
- B.25. Test dziedzicznych translokacji na myszach
Ocena efektów genotoksycznych:
- B.16. Test rekombinacji mitotycznych na komórkach Saccharomyces cerevisiae
- B.18. Uszkodzenie i naprawa DNA. Nieplanowa Synteza DNA. Badanie na komórkach ssaków in vitro
- B.19. Test wymiany chromatyd siostrzanych in vitro
- B.39. Test nieplanowej syntezy DNA na komórkach wątroby ssaków in vivo
Metody alternatywne do oceny potencjalnego efektu kancerogennego
- B.21. Badanie transformacji komórek ssaków in vitro
>> B.40. Działanie żrące na skórę
- test przezskórnej oporności elektrycznej (TER)
- test wykorzystujący model ludzkiej skóry (EPISKINTM; EpiDermTM)
>> B.41. Fototoksyczność in vitro - Test wychwytu czerwieni obojętnej na fibroblastach 3T3
>> B.42. Działanie uczulające na skórę: test LLNA   
Metody alternatywne zwalidowane przez ECVAM Scientific Advisory Committee (ESAC), lecz nie zawartych jeszcze w ustawodawstwie UE:
>> Test działania żrącego na skórę - CorrositexTM (ESAC 2000)
>> Test absorpcji przezskórnej in vitro (OECD TG 428, 2004)
>> 5 testów na pirogenność (ESAC 2006)
>> Test genotoksyczności - test mikrojądrowy in vitro (ESAC 2006; draft OECD TG 487, 2006)
>> Testy działania embriotoksycznego
- Embryonic Stem Cell Test (EST) (ESAC 2002)
- Postimplantation Rat Whole-Embryo Culture (WEC) (ESAC 2002)
- Limb Bud Micromass Test (MM) (ESAC 2002)
>> Testy działania drażniącego na skórę
- Epi-SkinTM    (ESAC 2007)
- EpiDermTM    (ESAC 2007)
>> Test działania uczulającego na skórę - test rLLNA – zredukowany test LLNA (ESAC 2007)

Testy alternatywne w trakcie rozwoju i walidacji oceniające:
>> działanie drażniące na oko
>> toksyczność ostrą
- wspólna walidacja ostrej toksyczności układowej przez ICCVAM/ECVAM
- A-Cute-Tox - Integrated Project
>> działanie żrące na skórę (QSAR, in silico)
>> toksyczność na rozród
- ReProTect - Integrated Project

Potrzebne są wciąż nowe testy alternatywne m.in. do oceny fotoalergii, toksyczności przewlekłej/podprzewlekłej, toksyczności narządowej/układowej, biokinetyki, działania kancerogennego na drodze epigenetycznej (nie-genotoksycznej).

---

mgr Joanna Arkusz, dr Maciej Stępnik
mgr Joanna Arkusz (joanna@imp.lodz.pl), dr Maciej Stępnik (mstep@imp.lodz.pl)
Instytut Medycyny Pracy w Łodzi, Pracownia Toksykologii Molekularnej