Bakterie kwasu octowego należą do mikroorganizmów wykorzystywanych przez człowieka od blisko 10000 lat. Pełnią one szereg pożytecznych funkcji technologicznych, bez nich nie byłaby możliwa ogromna część procesów biotransformacji. Procesy te wykorzystują aktywność drobnoustrojów w zakresie enzymatycznych przekształceń różnorodnych egzogennych związków chemicznych do strukturalnie podobnych produktów, które nie wykazują zazwyczaj Żadnej funkcji metabolicznej i gromadzone są pozakomórkowo. Procesy biotransformacji nie dostarczają energii, ani prekursorów do syntez komórkowych i przebiegają przy udziale niewielkiej liczby enzymów. Bakterie octowe posiadają zdolność syntezy enzymów katalizujących biotransformacje różnych związków organicznych. Dzięki nim można pozyskać wiele cennych związków takich jak kwas octowy, kwas glukonowy, bakteryjną celulozę oraz dihydroksyaceton (DHA), który znalazł zastosowanie w przemyśle farmaceutycznym, kosmetycznym, spożywczym i chemicznym.
Dihydroksyaceton w warunkach przemysłowych otrzymuje się drogą chemiczną i mikrobiologiczną. Synteza chemiczna może przebiegać poprzez katalityczne utlenianie glicerolu lub poprzez kondensację formaldehydu z węglanem wapnia. Pod wpływem związków chemicznych proces przekształcania glicerolu w dihydroksyaceton przebiega w sposób niejednorodny z jednoczesnym powstawaniem złożonych i trudnych do usunięcia związków, a wydajność konwersji nie przekracza kilku procent. Ze względu na rosnące zapotrzebowanie na dihydroksyaceton podjęto próbę chemicznego pozyskania tego związku. Ważnym odkryciem okazała się zaproponowana przez Kimura katalityczna synteza DHA, która polegała na utlenianiu glicerolu z zastosowaniem platynowo-bizmutowego katalizatora osadzonego na nośniku z granulowanym węglem drzewnym. Pozwoliło to na utlenienie 50% wodnego roztworu glicerolu o pH 4-5 z 30% wydajnością. Próby katalitycznego utleniania glicerolu podejmowane były wielokrotnie, jednak za każdym razem wydajność tego procesu była stosunkowo niska. Skłoniło to naukowców do intensyfikacji badań na pozyskiwaniem dihydroksyacetonu drogą biotechnologiczną. Działalność oksydacyjna bakterii octowych w stosunku do większości substratów węglowych wykazuje specyfikę ujętą regułą Bertranda i Hudsona, dotyczącą struktury przestrzennej związków podatnych na utlenianie. W myśl tej zasady drugorzędowe grupy hydroksylowe alkoholi wielowodorotlenowych mogą zostać utlenione, jeżeli znajdują się między pierwszorzędową grupą hydroksylową, a inną grupą hydroksylową, z którą tworzą konfigurację „cis”. Zgodnie z tą regułą podczas utleniania glicerolu przez bakterie octowe o właściwościach ketogennych jedynym produktem reakcji jest DHA (rys. 1).
Rys. 1. Utlenianie glicerolu do dihydroksyacetonu przy udziale bakterii z gatunku Gluconacetobacter xylinus [Chmiel, 1998].
Reakcja biotransformacji glicerolu do DHA prowadzona jest przy udziale związanej z błoną cytoplazmatyczną dehydrogenazy glicerolowej (GDH, ang. glycerol dehydrogenase) (EC 1.1.1.6), której centrum aktywne zlokalizowane jest w przestrzeni peryplazmatycznej [Bauer i wsp., 2005]. Dzięki takiej lokalizacji wymagający nakładów energii transport substratów do komórki i produktów z komórki do podłoża nie jest konieczny. Metabolizm glicerolu jako jedynego źródła węgla dla bakrerii kwasu octowego może przebiegać dwoma sposobami, zależnymi od pH podłoża.
Pierwszy sposób metabolizmu jest niezależny od adenozynotrifosforanu (ATP) oraz jonów magnezu Mg2+ i polega na bezpośredniej konwersji glicerolu do DHA. Reakcja ta zachodzi przy pH 5-5,5. W tych warunkach glicerol jest wykorzystywany przez bakterie, a powstający DHA zostaje uwolniony do podłoża lub jest dalej metabolizowany przez komórki drobnoustrojów. Proces ten został przedstawiony na rys. 2.
Rys. 2. Metabolizm glicerolu przez bakterie. GDH-dehydrogenaza glicerolowa; DAKkinaza dihydroksyacetonowa; TIM-izomeraza triozofosforanowa; F6P-fruktozo-6-fosforan; GAP-fosforan 3-gliceraldehydu [Erni i wsp., 2006].
Drugi szlak, przedstawiony na rys. 3, przebiega przy pH 8,5-10 i polega na utworzeniu 3fosfoglicerolu w obecności ATP, jonów Mg 2+ i kinazy glicerolowej.
Rys. 3. Metabolizm glicerolu przez bakterie kwasu octowego w pH 8,5.
GK-kinaza glicerolowa; G3PGH-dehydrogenaza 3-fosfoglicerolowa; GPO-oksydaza 3-fosfoglicerolowa; PEPfosfoenolopirogronian; L-G3P-3-fosfoglicerol; DHAP-fosfodihydroksyaceon; ATP -adenozynotrifosforan; ADP -adenozynodifosforan [Hettwer i wsp., 2002; Holst i wsp., 1982].
Dihydroksyaceton, produkt utleniania drugiej grupy hydroksylowej glicerolu, był po raz pierwszy otrzymany na drodze biotechnologicznej z wykorzystaniem bakterii z gatunku Acetobacter xylinum (obecnie Gluconacetobacter xylinus) w 1896 roku przez Bertranda. Od tego momentu uważano, Se biotransformacja jest jedyną metodą pozwalająca na otrzymanie DHA z glicerolu. W obecności glicerolu w pożywce hodowlanej bakterie kwasu octowego uruchamiają ekspresję genu kodującego dehydrogenazę glicerolową, odpowiedzialną za przemianę gliceryny w DHA (rys. 1).
Prace nad Użyciem immobilizowanych komórek bakterii z gatunku Gluconacetobacter xylinus (dawniej Acetobacter xylinum) do produkcji dihydroksyacetonu zostały podjęte w 2007 roku przez naukowców z Zakładu Biotechnologii i Mikrobiologii śywności SGGW. Dotychczas ustalono, Se najwięcej DHA, tj. 10,93mg/cm3 uzyskano po 36 h hodowli bakterii octowych w podłożu produkcyjnym przy pH 5.0 (optymalnym dla bakterii kwasu octowego) i 10% zawartości glicerolu w podłożu. Ponadto zaobserwowano, Se wzrost kwasowości czynnej podłoża do wartości pH 7.0 lub 8.0 (optymalnego dla dehydrogenazy glicerolowej) wpłynął istotnie na zwiększenie uzysku DHA w podłożach zawierających 3% albo 5% glicerolu. Obecnie duże nadzieje pokłada się w możliwości immobilizacji enzymów bakteryjnych i prowadzeniu procesu biotransformacji przy pH optymalnym dla dehydrogenazy glicerolowej. Eliminacja komórek bakterii octowych ze środowiska biotransformacji pozwala na prowadzenie procesu przemiany glicerolu w DHA bez ryzyka, Se otrzymany produkt ulegnie przekształceniu w fosfodihydroksyaceton. Dodatkowo ogranicza to możliwość zahamowania metabolizmu komórek bakterii octowych przez wzrastające stężenie DHA, co pozwala na zwiększenie wydajności procesu. Stosowanie unieruchomionych enzymów zmniejsza niekorzystne oddziaływanie procesu biotransformacji na środowisko, umożliwia pełniejsze wykorzystanie Użytych surowców oraz redukcję produktów ubocznych. możliwości takie stwarza także genetyka. Pierwsze próby wykorzystania inżynierii genetycznej w procesie biotransformacji podjęto w latach 90-tych Zaobserwowano, SeuSycie rekombinowanych szczepów bakterii z gatunku Gluconobacter oxydans DSM 2343 oraz ekspresja genów sldA i sldB, kodujących dehydrogenazę glicerolową, pozwalają na zwiększenie tolerancji tych bakterii na DHA oraz zwiększenie wydajności procesu. Dzięki tej metodzie, podczas hodowli bakterii w podłożu zawierającym 50 g/dm3 glicerolu, 2,5 g/dm3 ekstraktu droSdSowego, 2 g/dm3 (NH4)2SO4, 1 g/dm3 MgSO*7H2O, 0,9 g/dm3 KH2PO4, 0,1 g/dm3 K2H PO4, po 48 godzinach uzyskano 30 g/dm3 dihydroksyacetonu. Obecnie duże nadzieje pokładane są w inżynierii genetycznej zarówno w rekombinacji DNA in vitro jak i hybrydyzacji DNA na drodze fuzji protoplastów. Użycie szczepów skonstruowanych na drodze rekombinacji genetycznej, które zawierają geny kodujące dehydrogenazę glicerolową o wysokiej aktywności pozwala na efektywne przekształcenie glicerolu do DHA. Do intensyfikacji procesu biotransformacji może również znaleźć zastosowanie fuzja protoplastów. Skrzyżowanie szczepów bakterii octowych o pożądanych cechach biochemicznych stwarza szansę pozyskania rekombinatów produkujących większą ilość dehydrogenazy glicerolowej co w efekcie doprowadzi do zintensyfikowania biotransformacji. Wykorzystanie organizmów zrekombinowanych genetycznie umożliwia istotną poprawę wydajności prowadzonej biotransformacji i jest to jak dotąd najbardziej efektywny zabieg. Należy przypuszczać, Se w najbliższym czasie zostaną podjęte kolejne badania wykorzystujące metody inżynierii genetycznej w celu doskonalenia szczepów bakterii kwasu octowego, a przez to procesów biotechnologicznych przebiegających z ich udziałem. Być może pozwoli to na zwiększenie wydajności przy jednoczesnym obniżeniu kosztów produkcji DHA metodami mikrobiologicznymi.
Spis piśmiennictwa
Assai T., 1968. Acetic Acid Bacteria: Classification and Biochemical Activities, University of Tokyo Press, Tokyo, 27–32.
Bednarski W., Reps A., 2003. Biotechnologia Żywności. Wyd. II., WNT, Warszawa 2003, 218-222, 446-457.
Chmiel A., 1998. Biotechnologia-podstawy mikrobiologiczne i biochemiczne. Wyd. III., PWN, Warszawa 1998, 34-36, 204-210.
Claret C., Salmon JM., Romieu C., Bories A., 1994. Physiology of Gluconobacter oxydans during dihydroxyacetone production from glicerol. Appl. Environ. Microbiol. 41: 359-365.
Doelle H. W., 1969. Bacterial metabolism. Academic Press, New York and London, vol 2, 124-150.
Erni B., Siebold C., Christen S., Srinivas A., Oberholzer A., Baumann U., 2006. Small substrate, big surprise: fold, function and phylogeny of dihydroxyacetone kinases. Cell. Mol. Life. Sci. 63: 890-900.
Gatgens C., Degner U., Bringer-Meyer S., Herrmann U., 2007. Biotransformation of glicerol to dihydroxyacetone by recombinant Gluconobacter oxydans DSM 2343. Appl. Microbiol. Biotechnol. 76: 553-559.
Hekmat D., Bauer R., Fricke J., 2003. Optimization of the microbial synthesis of dihydroxyacetone from glycerol with Gluconobacter oxydans. Bioprocess. Biosyst. Eng. 26: 109-116. Hettwer J., Oldenburg H., Flaschel E., 2002. Enzymic routes to dihydroxyacetone phosphate or immediate precursors. J. Of Mol. Catal. 19-20: 215-222.
Holst O., Lundback H., Mattiasson B., 1985. Hydrogen peroxide as an oxygen source for immobilized Gluconobacter oxydans converting glycerol to dihydroxyacetone. Appl. Microbiol. Biotechnol. 22: 382-388.
Kimura H., 1993. Selective oxidation of glycerol on platinum-bismuth catalyst by using a fixed bed reactor. Appl. Catal. 105: 147-158.
Prust i wsp., 2005. Prust C., Hoffmeister M., Liesegang H., Wiezer A., Fricke WF., Ehrenreich A., Gottschalk G., Deppenmeier U., 2005. Complete genome sequence of acetic acid bacterium Gluconobacter oxydans. Nat. Biotechnol. 23: 195-200.
Tkač J., Navratil M., Strudik E., Gemeiner P., 2001. Monitoring of dihydroxyacetone production during oxydation of glycerol by immobilized Gluconobacter oxydans cells with an enzyme biosensor. Enzyme. Microbiol. Technol. 28: 383-388.
Opracowała mgr inS. Anna Ratz – absolwentka Wydziału Nauk o śywności, Zakład Biotechnologii i Mikrobiologii śywności SGGW, Politechniki Warszawskiej-Wydział Chemiczny-„Chemia kosmetyczna”, obecnie Szkoła Główna Handlowa-Kolegium Zarządzania i Finansów-Katedra Zarządzania Jakością– „MenadSer Jakości”.
mgr inż. Anna Ratz
Anna Ratz
Absolwentka Wydziału Nauk o żywności, Zakład Biotechnologii i
Mikrobiologii żywności SGGW,
Politechniki Warszawskiej-Wydział Chemiczny-„Chemia kosmetyczna”,
obecnie Szkoła Główna Handlowa-Kolegium Zarządzania i Finansów-Katedra Zarządzania Jakością–
„Menadżer Jakości”.
KOMENTARZE