J. Bazan¹

¹Akademia Medyczna we Wrocławiu, Katedra  i Zakład Biochemii Lekarskiej,50-368 Wrocław, ul.Chałubińskiego 10

Bakteriofagi są użytecznymi narzędziami w biologii. Wiele zagadnień mikrobiologii i biologii molekularnej zostało wyjaśnionych dzięki eksperymentom prowadzonym przy użyciu bakteriofagów.  Są to oczywiście badania nad układem fag-gospodarz, prowadzące do poznania cyklów rozwojowych wirusów, ale także poznawanie struktur genów i mechanizmów regulatorowych, w bakteriofagach po raz pierwszy zaobserwowano nachodzenie się genów i enzymy restrykcyjne, a pierwszy zsekwencjonowany genom należał do bakteriofaga. Bakteriofagi dostarczyły także niezbędne dla inżynierii genetycznej narzędzia [1, 2].

Czym jest fagoterapia?

Terapia fagowa jest jedną z form terapii antybakteryjnej, stosowaną przede wszystkim wówczas, gdy zawodzą antybiotyki. W terapii tej wykorzystuje się bakteriofagi, które mają zdolność do namnażania się i lizy bakterii wywołującej infekcję. Uwolnione wiriony atakują kolejne komórki bakteryjne likwidując całą populację. Zdolność zabijania bakterii patogennych przez bakteriofagi lityczne stała się podstawą  do wprowadzenia tych wirusów do leczenia infekcji bakteryjnych.

Idea fagoterapii nie jest nowa, gdyż niedługo po odkryciu bakteriofagów na początku lat 20. XX wieku, F.H. d’Hérelle podjął pierwsze próby leczenia z użyciem tych wirusów, a duże zainteresowanie terapią trwało do lat 40. W latach 30. produkowano nawet komercyjne preparaty fagowe. W czasie Drugiej Wojny Światowej obie walczące strony wykorzystywały fagi do leczenia czerwonki u żołnierzy. Słaba znajomość natury fagów oraz ich niewłaściwe stosowanie, a przede wszystkim wprowadzenie antybiotyków były powodem spadku zainteresowania fagoterapią w latach późniejszych. W ostatnich latach, z powodu wzrastającej liczby szczepów bakteryjnych opornych na antybiotyki, fagoterapia stała się znów obiektem zainteresowań firm i ośrodków naukowych, na całym świecie.

Pod koniec 2005 roku Instytut Immunologii i Terapii Doświadczalnej PAN we Wrocławiu otworzył pierwszy w Unii Europejskiej Ośrodek Terapii Fagowej, gdzie prowadzi eksperymentalne leczenie chorych zakażonych antybiotykoopornymi bakteriami [1, 3, 4, 5].

Samoreplikujące się fagi zostały potraktowane jak konwencjonalne leki. Wprowadzone zostały metody dzięki którym można określić ich aktywność antybakteryjną. W tym celu stosuje się symulacje komputerowe, wykorzystujące poznane już zależności bakteriofag-bakteria oraz równania kinetyczne. Pozwala to na określenie skuteczności terapii fagowej, dobranie odpowiedniej dla danego pacjenta dawki oraz czasu leczenia [5].

Bakteriofagi a antybiotyki

Bakteriofagi mogą infekować jedynie komórki określonego gospodarza bakteryjnego, dlatego też terapia fagowa budzi obecnie tak duże zainteresowanie. Fagi lityczne potrafią skutecznie zwalczyć infekcję bakteryjną, przy czym podawane doustnie nie niszczą naturalnej flory bakteryjnej przewodu pokarmowego. Fagi posiadają silne działanie bakteriobójcze in vitro i in vivo przeciwko bakteriom Gram-dodatnim i Gram-ujemnym.

Istnieją dane doświadczalne wykazujące większą skuteczność pojedynczej dawki faga od powtarzalnych 4 dawek różnych antybiotyków w mysim modelu infekcji. Dzieje się tak dzięki namnażaniu się fagów, a więc zwiększaniu ich ilości, w miejscu infekcji. Ma to szczególne znaczenie w infekcjach zlokalizowanych w słabo ukrwionych tkankach, gdzie antybiotykoterapia nie daje pożądanych rezultatów. Bakteriofagi jako lek mają unikatową cechę samoistnego zwiększania dawki podczas trwania infekcji, natomiast po zabiciu wszystkich bakterii patogennych, fagi zostają usunięte z organizmu, gdyż nie są w stanie rozwijać się w komórkach eukariotycznych. Dużym atutem bakteriofagów jest fakt, iż w przypadku nabycia przez bakterie oporności np. dzięki mutacjom, fagi również wprowadzają zmiany w swoim genomie dostosowując się do gospodarza. Cecha ta nie występuje w przypadku innych terapii. Fagi stosuje się już w dawce 103 cząstek wirionów, a podane doustnie mogą przenikać do krwi i w szybkim tempie docierać do narządów wewnętrznych tj. wątroba, śledziona, nerki, przenikają także do otrzewnej oraz mają zdolność do pokonywania bariery krew-mózg. Dzięki temu fagoterapia wykazuje wysoką skuteczność (ponad 90%) w leczeniu takich infekcji jak zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych, zapalenie kości i szpiku, zapalenie kości po złamaniu, zakażenie układu moczowego, przewlekłe ropne przetoki, zapalenie powiek, spojówek, ucha środkowego, ropnie skóry, ropowica, trądzik martwiczy i ropnie gruczołu piersiowego. Na podkreślenie zasługuje fakt, że aż w 87 z 98 przypadków posocznicy osiągnięto pozytywny efekt terapeutyczny. Bakteriofagami leczono (doustnie i miejscowo, średnio przez 4 tyg.) również 7 pacjentów po zabiegu na otwartym sercu i dużych naczyniach z ostrym ropnym zapaleniem osierdzia, wywołanym przez Staphylococcus (5 przypadków) albo mieszaną infekcję Staphylococcus i Pseudomonas lub Escherichia (2 przypadki), u których antybiotykoterapia była nieskuteczna. Fagoterapię można skutecznie stosować u dzieci, a nawet u noworodków [1, 3].

Strój i wsp. na Oddziale Niemowlęcym Zespolonego Szpitala Dziecięcego w Sosnowcu stosowali fagoterapię preparatem zawierającym pojedynczy szczep faga lizujący pałeczki Klebsiella u noworodka urodzonego w 35. tyg. ciąży poprzez cięcie cesarskie (1 punkt w skali Apgar), u którego od pierwszej doby występowały objawy posocznicy z ropnym zapaleniem opon mózgowo-rdzeniowych wywołanej przez oporny na stosowane antybiotyki szczep Klebsiella pneumoniae. Terapia spowodowała wyjałowienie płynu mózgowo-rdzeniowego, poprawę stanu ogólnego, przyrost masy ciała i normalizację wyników laboratoryjnych [6].

Istnieją obawy, że fagi powodując szybkie zniszczenie dużej liczby bakterii Gram-ujemnych, mogą przyczynić się do uwolnienia dużej dawki endotoksyn bakteryjnych, co może stanowić duże obciążenie dla wątroby i być przyczyną wielu skutków ubocznych łącznie z wstrząsem kardiogennym, co miało miejsce w przypadku antybiotykoterapii. Jednak jak dotąd nie zaobserwowano takich objawów w przypadku fagoterapii [3].

Jak już wspomniano ukierunkowane działanie fagoterapii czyni ją „łagodniejszą” od terapii antybiotykowej, jednak wymusza dokładne sprawdzenie in vitro szczepu wywołującego infekcję oraz dobranie właściwego faga (typowanie fagowe). By zwiększyć skuteczność terapii często podaje się tzw. koktajl fagowy [7], czyli mieszaninę kilku różnych fagów.

Istotnym czynnikiem ograniczającym skuteczność terapii fagowej jest szybki klirens fagów, zależny od niespecyficznego wychwytywania wirionów przez układ siateczkowo-śródbłonkowy wątroby i śledziony.  By temu zapobiec stosuje się fagi o wydłużonym okresie półtrwania w surowicy, uzyskiwane za pomocą metody seryjnego pasażu. Kolejnym czynnikiem ograniczającym skuteczność tej terapii jest immunogenność fagów. Jednak na ogół krótki okres podawania bakteriofagów oraz stosowanie terapii doustnie powoduje ograniczenie tego zjawiska [8, 3].

Zastosowanie fagoterapii

Fagoterapia nie odnosi się jedynie do leczenia infekcji bakteryjnych u ludzi. Fagi są coraz chętniej stosowane w rolnictwie i przemyśle. Wykorzystywane są one do diagnostyki, jako czynnik indykatorowy. Terapia fagowa stosowana jest jako forma biokontroli w hodowlach roślin, jej zastosowanie pozwala także na mniejsze zużycie środków chemicznych w produkcji rolnej. Skuteczną terapię fagową zastosowano w leczeniu takich roślinnych zakażeń bakteryjnych jak:

- infekcje Xanthomonas pruni – związane z bakteryjną plamistością drzew pestkowych

- infekcje Xanthomonas campestris u drzew brzoskwiniowych, kapusty i pieprzu

- infekcje Ralstonia solanacearum w hodowli tytoniu

- rdza ogniowa czy zgnilizna, związane z infekcjami rodzajem Erwinia

- plamistość liści fasoli Mung

- infekcje ziemniaków przez bakterie Streptomyces scabies, wywołujące parch zwykły ziemniaka

- plamistość rdzawa grzybów wywołana przez Pseudomonas tolaasii (P. fluorescens)

- Sallmonella, na świeżo ściętych owocach

- rdza bakteryjna pomidorów wywołana przez X. campestris

Bakteriofagi mogą także likwidować bakterie konkurencyjne dla bakterii brodawkowych, zwiększając tym samym możliwość wiązania azotu przez rośliny motylkowe.

Fagoterapię stosuje się także do leczenia infekcji u zwierząt hodowlanych tj. drób, bydło, trzoda chlewna oraz ryby. Ponieważ zwierzęta są narażone na infekcje bakteryjne, patogeny mogą być przenoszone na ludzi za pośrednictwem takich produktów jak mięso, mleko czy jajka. Dlatego też stosowanie terapii fagowej u zwierząt staje się coraz bardziej powszechne. Skuteczną terapię fagową zastosowano w leczeniu takich zwierzęcych zakażeń bakteryjnych jak:

- Aeromonas hydrophila i Edwardsiella tarda u węgorzy

- E. coli u bydła

- E. coli u ptactwa domowego

- Campylobacter jejuni u kurczaków

- Lactococcus garvieae u ryb morskich z gatunku Seriola dorsalis

- Pseudomonas plecoglossicida u ryb

- Salmonella enterica u kurczaków

- Salmonella typhimurium u świń i kurczaków

Terapia ta jest skuteczniejsza od terapii antybiotykowej, a ponadto pozwala na wytwarzanie bezpiecznych i zdrowych, wolnych od antybiotyków, produktów.

W przemyśle fagoterapia znalazła zastosowanie w redukcji bakterii patogennych w produktach spożywczych, które nie ulegają znacznemu przetworzeniu np. obróbce termicznej. Metoda ta jest bardzo prosta, tania a przede wszystkim bardzo skuteczna. Stosuje się ją w przetwórstwie takich produktów jak:

- surowe mięso, potencjalnie zawierające patogenną E. coli O157:H7 i Listeria monocytogenes

- jajka, potencjalnie zawierające bakterie z rodziny Salmonella

- sery, potencjalnie zawierające bakterie z rodziny Listeria i Salmonella

- drób, potencjalnie zawierający bakterie z rodziny Campylobacter i Salmonella

- świeże owoce, potencjalnie zawierające bakterie z rodziny Salmonella [9]

Zastosowanie bakteriofagów w przemyśle budzi jeszcze wiele obaw. Z jednej strony mogą one przyczynić się do polepszenia jakości produktów. Zastosowanie odpowiednich bakteriofagów w produkcji np. przetworów mlecznych może przyczynić się do rozwiązania wielu problemów z utrzymaniem odpowiedniej flory bakteryjnej na każdym etapie produkcji, co pozwala na znaczne obniżenie strat oraz na standaryzację produkcji i zachowanie jednakowych cech produktu. Fagi mogą także być z powodzeniem stosowane w produkcji czystych drożdży wolnych od bakterii. Jednak z drugiej strony wprowadzenie niewłaściwego faga do produkcji przemysłowej może przyczynić się do ogromnych strat spowodowanych zahamowaniem procesów technologicznych wynikającym z lizy szczepów bakteryjnych wykorzystywanych do tej produkcji. Opracowywane są także metody pozwalające na redukcję biofilmu, który tworzy się w instalacjach przemysłowych.

Jak już wielokrotnie wspominano, bakteriofagi stosowane są również w medycynie. Należy zwrócić uwagę nie tylko na ich terapeutyczne zdolności, ale również na zastosowanie fagów do oczyszczania aparatury medycznej, bada się także możliwość wykorzystania bakteriofagów do skutecznej terapii antynowotworowej [10].

Choć bakteriofagi towarzyszyły ludziom do wieków, dopiero ich ponowne odkrycie na początku XX wieku spowodowało rozwój badań nad tymi wirusami. Stało się tak przede wszystkim z powodu pojawienia się odpowiedniej aparatury i metod badawczych pozwalających na obserwację tych wirusów. Także wzrastająca ilość infekcji antybiotykoopornych spowodowała wzrost zainteresowania alternatywnymi terapiami.

literatura:

[1] Gregoracci, G. B., et al., The biology of bacteriopfages, w G. Węgrzyn (red.), Modern bacteriophage biology and biotechnology. Research Signpost, Trivandrum, India, 2006

[2] Karam, J.D., Bacteriophages: The viruses for all seasons of molecular biology, Virology Journal, 2005, 2:19

[3] Międzybrodzki, R., Borysowski, J., Fortuna, W., Weber-Dąbrowska, B., Górski, A., Terapia fagowa jako alternatywa w leczeniu zakażeń wywołanych przez bakterie antybiotykooporne, Kardiochirurgia i Torakochirurgia Polska, 2006, 3 (2), 201-205

[4] Brüssow, H., Phage therapy: the Escherichia coli experience, Microbiology, 2005, 151, 2133-2140

[5] Zwiefka, A., Weber−Dąbrowska, B., Górski, A., Symulacje komputerowe terapii fagowej, Advances In Clinical And Experimental Medicine, 2003, 12, 1, 105-109

[6] Strój, L., Weber-Dąbrowska, B., Partyka, K., Mulczyk, M., Wójcik, M., Skuteczne zastosowanie bakteriofagoterapii w ropnym zapaleniu opon mózgowo-rdzeniowych u noworodka. Neurologia i Neurochirurgia Polska, 1999, 33, 693-698

[7] Tanji, Y., et al., Therapeutic Use of Phage Cocktail for Controlling Escherichia coli O157:H7 in Gastrointestinal Tract of Mice, Journal Of Bioscience And Bioengineering, 2005, 100 (3), 280-287

 [8] Górski, A., Weber-Dąbrowska, B., The potential role of endogenous bacteriophages in controlling invading pathogens, CMLS, Cell. Mol. Life Sci., 2005, 62, 511-519

[9] Terapia bakteriofagami. dostęp: 22.03.11, artykuł on-line:www.wirusologia.republika.pl

[10] Bar, H., Yacoby, I.,  Benhar, I., Killing cancer cells by targeted drug-carrying phage nanomedicines, BMC Biotechnology, 2008, 8:37