Komórki nowotworowe wraz ze wzrostem guza rozpoczynają ekspansję na otaczające go tkanki, następnie przedostają się do naczyń krwionośnych lub limfatycznych i ostatecznie przechodzą przez ściany układu naczyń do oddalonych od guza organów. Tam dochodzi do kolonizacji nowych miejsc oraz  proliferacji komórek nowotworowych aż do uformowania kolejnego guza.Obecnie przypuszcza się, że blisko 90 % przypadków śmierci osób chorych na raka spowodowane jest właśnie poprzez wejście komórek nowotworowych w stan metastazy.

Sceptryna, naturalny związek chemiczny produkowany przez różnorodną grupę morskich gąbek wykazuje istotną zdolność do inhibicji ruchliwości komórek kilku typów nowotworów.

Migracja komórek nowotworowych związana jest z ich ruchliwością. Dogłębne poznanie mechanizmów rozprzestrzeniania się komórek rakowych po organizmie oraz ich ruchliwości, pozwala na szerszy wgląd w biologię nowotworów i opisanie fenotypów poszczególnych odmian.

Komórki nowotworowe mogą odrywać się od macierzystego źródła zmian nowotworowych tworząc przerzuty. Komórki poruszają się w rozmaity sposób, zależnie od typu i stopnia zróżnicowania. Najpowszechniejszym mechanizmem ruchu komórek jest reorganizacja aktynowego cytoszkieletu. Dlatego też, kontrola migracji komórek nowotworowych poprzez wpływ na aktynowy cytoszkielet otwiera nowe możliwości w leczeniu nowotworów, a związki chemiczne takie jak sceptryna wydają się być odpowiednim do tego narzędziem.

Ruchliwość komórek

Mechanizmy pozwalające komórce wykonać ruch są zależne od aktynowego cytoszkieletu. Sama aktyna jest białkiem występującym bardzo licznie w każdej komórce eukariotycznej. Jest obecna w dwóch formach: G – jako globularny monomer i F – liniowy polimer jednostek monomerycznych tworzących filament.

Mechanizm reorganizacji szkieletu aktynowego

Ukierunkowana ruchliwość komórek jest bardzo istotna dla wielu z podstawowych procesów biologicznych. Wolno żyjące komórki, w płynnych środowiskach, poruszają się poprzez pływ, rzęski i wici. Komórki żyjące na stałych podłożach poruszają się ameboidalnie ruchem pełzakowatym. Dzięki ukierunkowaniu ruchliwości komórek możliwe są takie procesy jak zamykanie się ran, rearanżacja tkanek w trakcie dojrzewania płodu czy rozbudowa układu nerwowego. Ruchliwość komórek przyczynia się również do migracji komórek rakowych i metastazy. Ogólny mechanizm ruchliwości opartej o rearanżację aktyny jest bardzo konserwatywny i można go odnaleźć  zarówno w najprostszych organizmach, jak i w kręgowcach [1].

            In vivokomórki pełzają wewnątrz tkanki pomiędzy innymi komórkami w macierzy zewnątrzkomórkowej we wszystkich możliwych kierunkach, w trzech wymiarach. In vitro ruch komórek jest zazwyczaj ograniczony do dwuwymiarowej przestrzeni przez to iż posiewane są one na płytkach. Migrujące komórki muszą cechować się dużą zdolnością do polaryzacji, tak żeby odrębne procesy związane z ruchem mogły być zlokalizowane w różnych częściach tej samej komórki [2]. Aby wykonać ruch na podłożu komórka musi zwykle skoordynować w czasie trzy etapy:

1. Wysunięcie wiodącego końca komórki
2. Adhezja do podłoża, uwolnienie tylnej części komórki
3. Przesunięcie masy komórki w zadanym kierunku

Większość komórek zwierzęcych i organizmów jednokomórkowych, porusza się ruchem pełzakowym wynikającym z reorganizacji szkieletu aktynowego. Wysunięcie wiodącego końca komórki związane jest z polimeryzacją aktyny, która układa się w gęstą, dendrytyczną sieć. Dla właściwego wzrostu nowych filamentów aktynowych koniecznych jest obecność wielu specyficznych molekularnych komponentów. Szkielet aktynowy jest kotwiczony do podłoża przez złożoną sieć molekuł adhezyjnych. To połączenie zaś umożliwia przekazanie siły wytworzonej w czasie polimeryzacji aktyny do wydłużenia komórki w danym kierunku.

            Monomeryczna aktyna polimeryzuje w wyniku podniesienia siły jonowej roztworu, tworząc filament aktynowy. Jest to proces odwracalny, regulowany stężeniem jonów w cytoplazmie. Proces polimeryzacji jest sprzężony z równoległą hydrolizą ATP do ADP i P_i. Zdolność aktyny do odwracalnej polimeryzacji jest źródłem ruchliwości komórkowej. Włókna aktynowe są kurczliwe i odgrywają znaczącą rolę w ruchliwości komórek oraz ich kurczliwości podczas migracji. Kluczową cząsteczką regulującą ten proces jest mała GTPaza Rho, która oddziałując z kinazą Rho zależną ROCK, kontroluje polimeryzację i depolimeryzację włókien aktyny. Udowodniono że sceptryna, należąca do alkaloidów wiąże monomery aktyny, a to tłumaczy jej wpływ na kurczliwość komórek i potencjalne zastosowanie w kuracji metastazy nowotworów.

Badanie migracji komórek nowotworowych

Obecnie opracowano kilka systemów eksperymentalnych pozwalających zgłębiać wiedzę na temat migracji komórek nowotworowych. Większość z nich w niewielkim stopniu odpowiada sytuacji in vivo albo jest mało precyzyjna.

Pomiaryprowadzonein vivo bazują na skomplikowanych systemach wizualizacji do śledzenia pojedynczej komórki, oddzielającej się od pierwotnego guza. Niestety skrupulatne określenie migracji uniemożliwia złożoność i niestabilność mikrośrodowiska oraz interakcje z innymi komórkami, szczególnie z monocytami i limfocytami. Bardzo interesujący sposób badania inwazji komórek nowotworowych oderwanych od pierwotnego guza zaproponowali D. Irimia oraz M. Toner [3].

Zaprojektowali oni mikroprzepływowe urządzenie, które rozdziela komórki mechanicznie i kieruje do mikrokapilar o analogicznej wielkości w stosunku do wielkości komórek. Kiedy ruchliwość różnych linii komórek rakowych była ograniczona do pewnej wielkości kanału, dało się zaobserwować spontaniczną, szybką i ciągłą migrację pojedynczych komórek. Ponad 80% komórek wchodzących w kanały podczas pierwszych 6 h poruszało się od jednego końca do drugiego bez zatrzymywania się czy zmiany kierunku. Irimia i Toner udowodnili, że zarówno komórki pochodzące z różnych typów nowotworów, jak i komórki z jednej linii, cechują się różną zdolnością do migracji. Niektóre mogą poruszać się szybciej niż 100 μm/h (Rys.3). Zaletą opracowanej metody jest to, że komórki mogą poruszać się ciągle i szybko przez długi czas po określonych ścieżkach. Takie podejście do ruchliwości komórek nowotworowych jest bliższe sytuacji in vivo, gdzie komórki rozprzestrzeniają się od guza pierwotnego naczyniami krwionośnymi i limfatycznymi w trzech wymiarach.

Ciągła ruchliwość komórek nowotworowych objawia się spontanicznie, bez względu na czynniki zewnętrzne, co sugeruje obecność wewnętrznego mechanizmu kierującego migracją komórek nowotworowych indukowaną mechanicznym ograniczeniem. Aby zbadać ten mechanizm komórki nowotworowe wewnątrz kanałów były eksponowane na działanie leków wpływających na mikrotubule, po czym mierzono redukcję średniej prędkości migracji. Okazało się, że niektóre komórki są oporne na działanie zastosowanych środków chemicznych, i mimo ich obecności w dalszym ciągu wykazują zdolność do migracji. Tego typu komórki mogą pokonywać odległe dystanse w organizmie i kontynuować metastazę, pomimo stosowania środków medycznych. Choć ich ogólna prędkość jest niewielka, to znaczenie biologiczne dla organizmu jest znacznie większe w porównaniu z innymi komórkami nowotworowymi.

Ogólnie, obserwacja migracji komórek mechanicznie rozdzielonych w mikrokanały sugeruje, że ruchliwość indywidualnej komórki nowotworowej jest rezultatem wewnętrznego mechanizmu, który w szczególnych przypadkach może być oporny na działanie standardowych leków stosowanych podczas chemioterapii.

Naturalne, bioaktywne związki chemiczne izolowane z organizmów morskich – Sceptryna.

Organizmy morskie są źródłem ogromnej liczby bioaktywnych związków chemicznych. Izolowane z nich substancje charakteryzują się między innymi aktywnością antynowotworową, antyzapalną, przeciwbakteryjną i przeciwwirusową. Mogą także stymulować system odpornościowy, a niektóre posiadają właściwości przeciwbólowe [5].

Dobrymi producentami wtórnych metabolitów wykazujących zróżnicowaną biologiczną aktywność są gąbki morskie. Dotąd wyizolowano z nich ponad pięć tysięcy różnych substancji, a co roku odkrywanych jest średnio 200 nowych [6]. Ciekawą grupą związków chemicznych, produkowanych tylko przez organizmy morskie, a w szczególności gąbki, są alkaloidy bromopyrolowe. Członkiem tej dużej rodziny alkaloidów jest sceptryna. Pierwszy raz wyizolowana została w 1981 roku przez Faulknera z gąbek gatunku Agelas sceptrum. Sceptryna ostatnimi czasy znajduje się w centrum zainteresowania przemysłu farmaceutycznego gdyż wykazuje ona na szerokie spektrum aktywności. Wymienić tu można aktywność antybakteryjną i antygrzybiczą, antymuskarynową i antyhistaminową. Warto zaznaczyć, że sceptryna jest najlepszym niepeptydowym inhibitorem somatostatyny, co daje jej potencjalne zastosowanie w terapiach różnego rodzaju fibroz, czy choroby Alzheimera.

Sceptryna wykazuje jeszcze jedną, ważną, niedawno odkrytą aktywność biologiczną. Jest to inhibicja ruchliwości komórek. Z punktu widzenia mechaniki, ruchliwość komórek to szereg następujących po sobie faz rozciągania się i kurczenia komórki. Niektóre komórki, są zdolne do wytwarzania lamellopodiów, aby znaleźć się bliżej substratu. Front komórki przyczepia się wtedy do zewnątrzkomórkowego matriks, generowane są siły ciągnące i następuje w ten sposób ruch poprzez skurczenie ciała komórki i rozciągniecie ogona z tyłu komórki. Udowodniono, że sceptryna wiąże monomery aktyny, dzięki czemu wpływa na kurczliwość komórek.

Do tej pory sceptryna była badana przez niewielu naukowców i dość ciężko znaleźć publikacje skupiające się na jej właściwościach. Jedną z ciekawszych pozycji jest praca wykonana przez zespół Cipres, D. O’Malley, K. Li, D. Finlay, P. Baran, K. Vuori [4]. Wyniki przez nich zaprezentowane są bardzo obiecujące.

Inhibicja ruchliwości komórek

Bezpośredni efekt sceptryny na ruchliwość komórek badany był z zastosowaniem linii komórkowych ludzkiego raka szyjki macicy HeLa. Komórki znajdujące się w wykładniczej fazie wzrostu zostały wysiane na płytki z pełnym medium DMEM. W celu zwiększenia ruchliwości komórek, do hodowli dodano czynnika wzrostu hepatocytów HGF w stężeniu 10 ng/ml. Każda hodowla zawierała fluorescencyjną kroplę. Komórki potraktowano różnymi stężeniami sceptryny, następnie pozwolono im na migrację przez 24 h w 27 st C. Sceptryna w różnych stężeniach inhibowała ruchliwość komórek HeLa. Stwierdzono to na podstawie występowania wyraźnie krótszych dróg przebytych przez komórki potraktowane sceptryną w porównaniu z drogami komórek kontrolnych. Przebyte przez komórki drogi różniły się w zależności od zastosowanej dawki sceptryny. Przy największym stężeniu sceptryny, komórki były najmniej ruchliwe (Rys 4a).

Rys. 4 Komórki nowotworowe Hela w obecności sceptryny w różnych stężeniach pobudzone do ruchliwości HGF.
 

Po przeprowadzeniu doświadczenia, za pomocą specjalistycznego oprogramowania zostały policzone dokładne odległości przebyte przez komórki. Odległości te zostały wyrażone w pikselach i przedstawione na wykresie poniżej (rys. 5b). Widać wyraźnie, że im większe stężenie sceptryny, tym średnia przebyta przez komórkę droga jest mniejsza. Warto zaznaczyć, że sceptryna wytworzona syntetycznie działa wręcz identycznie jak naturalna sceptryna izolowana z gąbek morskich (rys. 5c).

Kolejnym doświadczeniem było sprawdzenie sceptryny jako inhibitora ruchliwości komórek w różnych typach komórek nowotworowych. W tym celu użyto linii komórkowej złośliwego raka piersi MDA-MB-231, linii komórkowej raka piersi A 549 oraz transferowanych receptorem HGF mysich fibroblastów 3T3. Do hodowli A549 i mysich fibroblastów dodano czynnika wzrostu hepatocytów aby zwiększyć ruchliwość komórek. Linia MDA-MB-231 charakteryzuje się naturalną, dużą ruchliwością komórek. Wyniki opracowane w taki sam sposób jak w poprzednim doświadczeniu ukazały, iż sceptryna wykazuje szeroką aktywność inhibującą ruchliwość komórkową wobec wszystkich testowanych linii komórkowych (rys.6)

Cytotoksyczność.

Fakt, iż sceptryna wpływa na ruchliwość komórek zrodziło następne pytania. Czy oprócz tej właściwości sceptryna ma jakiś wpływ na podziały komórkowe bądź apoptozę. Aby sprawdzić wpływ sceptryny na proliferację, komórki HeLa wysiano na płytkach z sześcioma studzienkami i pozwolono na wzrost w obecności lub przy braku 40µM sceptryny. W określonych odstępach czasu mierzono ilość komórek znajdujących się w wykładniczej fazie wzrostu. Kontrolę pozytywną stanowiła afidikolina, która jest inhibitorem proliferacji komórek. Do sprawdzenia potencjalnego wpływu sceptryny na apoptozę wykorzystano test ELISA wykrywający martwe komórki. Jako próbę pozytywną użyto 5nM staurosporyny, która wywołuje apoptozę. Wyniki zaprezentowane są na rysunkach poniżej (rys.7). Sceptryna nie wykazała wpływu na proliferację komórek w żadnym z badanych momentów. Nie odnotowano również wpływu sceptryny na apoptozę komórek, nawet przy stężeniu 100µM. Wnioski te dowodzą także temu, iż sceptryna nie jest toksyczna dla komórek i nie wykazuje żadnej cytotoksycznej aktywności wobec używanych w doświadczeniu linii komórkowych, nawet przy wysokich jej stężeniach.

W ten sposób udowodniono nową właściwość biologiczną sceptryny, jako związku inhibującego migrację komórek. Efekt inhibicji ruchliwości nie jest zależny ani od typu tkanki ani od typu komórek. Sceptryna jest aktywna w różnych liniach komórkowych, zarówno w przypadku linii ludzkiego raka piersi, raka płuc, jak i transformowanych mysich fibroblastów.

Formowanie lamellopodiów.

Z racji że sceptryna inhibuje ruchliwość komórek, kolejnym etapem doświadczeń było sprawdzenie czy ma ona wpływ na poszczególne etapy ruchu komórki, czy inhibuje ruch całościowo. W tym celu użyto hodowli komórek HeLa oraz MDA-MB-231 ze znakowaną GFP aktyną. Komórki HeLa potraktowano czynnikiem wzrostu hepatocytów HGF. Próby kontrolne stanowiły hodowle bez dodatku sceptryny. Komórkom pozwolono rosnąć wykładniczo przez 24 godziny w czterokomorowej płytce pokrytej fibronektyną. Podczas wzrostu przez 3 godziny co dwie minuty mikroskop konfokalny robił zdjęcia komórek. Rysunek 8 prezentuje wyniki tego doświadczenia. Ukazuje on kompozycję zdjęć, w której czerwony kolor oznacza czas 0, zielony oznacza zmiany zaszłe przez 1 godzinę, niebieski przez 2 godziny, a biały przez 3 godziny. Na podstawie zdjęć trudno znaleźć różnicę między komórkami traktowanymi sceptryną a nietraktowanymi. Zarówno jedne, jak i drugie demonstrują dynamiczne ruchy aktyny błony komórkowej, łącznie z wytwarzaniem lamellopodii.

Tak więc wnioskować można, iż sceptryna nie wykazuje wpływu na polimeryzację aktyny, która zachodzi podczas początkowego etapu ruchu komórki, jakim jest rozciąganie się błony komórkowej. Jednak wyniki te nasuwają pewną sugestię. Mianowicie, iż sceptryna jest inhibitorem sił odpowiadających za kurczenie się komórki, występujących podczas ruchu komórki, już po wytworzeniu lamellopodiów.

Inhibicja kurczliwości komórek.

Aby sprawdzić tę hipotezę wykorzystano metodę retrakcji skrzepu. W tym celu transferowane ludzką integryną α_IIbβ₃ komórki jajnika z chomika (CHOαβ) zmieszano z ludzką plazmą, trombiną i CaCl₂. Uformowanemu w ten sposób skrzepowi pozwolono na dwugodzinną retrakcję, następnie zrobiono mu zdjęcia. Jako pozytywną kontrolę wykorzystano inhibitor kalpainy XI, który zupełnie blokuje kurczliwość komórek. Jak widać na zamieszczonym poniżej rysunku, sceptryna znacznie redukuje poziom retrakcji skrzepu, w porównaniu do komórek nie traktowanych sceptryną (rys.5). Ten wniosek pozwolił przypuszczać iż sceptryna inhibuje ruchliwość komórek poprzez hamowanie kurczliwości komórek. Dzięki ITC można było sprawdzić czy sceptryna wiąże się bezpośrednio do aktyny. Jak pokazuje rysunek 9, sceptryna wiąże monomeryczną aktynę ze stałą dysocjacji K = 19.2 ± 0.2 µM.

Podsumowanie

Ruchliwość komórkowa jest jednym z czynników chorobotwórczych w różnorodnych schorzeniach, na przykład w chorobach nowotworowych czy chronicznym zapaleniu. Większość pacjentów dotkniętych chorobą nowotworową nie umiera z powodu lokalnych powikłań wywołanych obecnością guza, lecz na skutek odległych przerzutów nowotworowych i ogólnego wyniszczenia organizmu. Udowodniono, że związki chemiczne izolowane z morskich gąbek wykazują znaczącą aktywność biologiczną na komórki nowotworowe.  Badania prowadzone na sceptrynie potwierdzają hipotezę o jej istotnym wpływie na ruchliwość komórek nowotworowych. Połączenie tych odkryć z nowoopracowaną technologią badawczą pozwalającą na obserwację ruchliwości komórek, niesie ze sobą optymistyczne prognozy na dalsze badania prekliniczne i rozwój środków terapeutycznych. Umożliwia również opracowywanie nowych strategii wykorzystywanych podczas badań nad nowymi lekami oraz terapeutykami, które przykładowo hamowałyby ruchliwość komórek i stanowiły alternatywę dla chemioterapii w walce z rakiem.

Bibliografia:

1. P. Lenz (2008) Cell Motility, Biological and Medical Physics, Biomedical Engineering, Springer
2. R. Ananthakrishnan, A. Ehrlichem (2007) The Forces Behind Cell Movement, International Journal of Biological Science
3. D. Irimia, M. Toner (2009) Spontaneous migration of cancer cells under conditions of mechanical confinement, Integrative Biology
4. Cipres, D. O’Malley, K. Li, D. Finlay, P. Baran, K. Vuori (2009) Sceptrin, a Marine Natural Compound, Inhibits Cell Motility in a Variety of Cancer Cell Lines, ACS Chemical Biology
5. G. Shankar, B. Andaman, R. Lemmens-Gruber (2010) Cyclodepsipeptides from Marine Sponges: Natural Agents for Drug Research, Marine Drugs
6. M. Laport1, O. Santos, G. Muricy (2009) Marine Sponges: Potential Sources of New Antimicrobial Drugs, Current Pharmaceutical Biotechnology

Red. Tomasz Sznerch