1. Czym są i jak powstają mikromacierze DNA


Mikromacierze DNA to niewielkie szklane lub plastikowe płytki, na które naniesiono wiele tysięcy sond, z których każda jest specyficzna dla tylko dla jednego genu. Zastosowanie tego typu płytek umożliwia analizę w pojedynczym eksperymencie praktycznie całego genomu badanego organizmu. Mikromacierze DNA wykorzystywane są głównie w celu określania zmian w poziomie ekspresji genów, ale również do badań nad alternatywnym splicingiem (exon arrays, splice variant arrays), do analizy jednonukleotydowych polimorfizmów DNA (SNP arrays), czy określania rejonów oddziaływań białko-DNA, wykrywania nowych transkryptów, badania takich procesów jak metylacja czy acetylacja chromatyny oraz innych zmian epigenomicznych (tiling arrays).
Mikromacierze DNA znalazły szerokie zastosowanie w medycynie, gdzie wykorzystywane są do poznawania mechanizmów chorobotwórczych, identyfikacji wskaźników pozwalających na ocenę ryzyka rozwoju chorób oraz określenia nowych obiektów, na których powinno koncentrować się działanie leków. Technika ta umożliwia również postawienie dokładniejszej diagnozy i dostosowanie leczenia do indywidualnego przypadku pacjenta.
Szczególnie szerokie zastosowanie technika mikromacierzy DNA znalazła w onkologii. Pozwoliła między innymi na określenie grupy 70 genów, których profil ekspresji pozwala odróżnić łagodną formę raka prostaty od formy złośliwej. Podobne grupy genów o zmienionym profilu ekspresji określono również dla raka piersi, nowotworów okrężnicy i przełyku, białaczki i wielu innych. Grupy takie pozwalają precyzyjnie zdiagnozować rodzaj nowotworu, prognozować dalszy rozwój choroby i odpowiednio dostosować strategię leczenia do indywidualnego przypadku pacjenta [1].
Obok mikromacierzy służących do badania ekspresji genów w onkologii szerokie zastosowanie znalazły również mikromacierze SNP. Wykorzystuje się je do identyfikacji powszechnie występujących w komórkach nowotworowych obszarów w obrębie których doszło do utraty heterozygotyczności (LOH). LOH jest zaburzeniem genetycznym powstającym w skutek utraty części materiału genetycznego, co w konsekwencji powoduje występowanie w danej komórce tylko jednego allelu danego genu [17]. Analizę obszarów LOH z wykorzystaniem mikromacierzy DNA przeprowadzono dla dużej grupy nowotworów, między innymi białaczki, raka piersi, raka prostaty, raka płuc czy nowotworu jajnika [6]. Analiza taka umożliwia identyfikację obszarów zawierających antyonkogeny, jest też niezwykle istotna dla charakterystyki stadium nowotworu i prognozowania o jego rozwoju [17]. Mikromacierze SNP wykorzystywane są również do wykrywania innych aberracji genetycznych, takich jak aneuploidia [21], trisomia [15] czy disomia rodzicielska [3], a także genów związanych z chorobami genetycznymi [14]. Z wykorzystaniem tej techniki wykryto między innymi geny związane ze stwardnieniem rozsianym, ciężką dziecięcą dystrofią siatkówki, cukrzycą noworodków czy chorobą afektywną dwubiegunową.
Mikromacierze DNA znalazły również zastosowanie w diagnostyce chorób zakaźnych, gdzie wykorzystywane są do detekcji i identyfikacji rodzaju wirusa [20], a także wykrywania genów odporności na antybiotyki w szczepach bakteryjnych [18].
Obok medycyny mikromacierze DNA cieszą się dużą popularnością również w sektorze farmaceutycznym. Wielkoskalowa analiza profilu ekspresji genów pozwoliła między innymi na identyfikację genów związanych z przerzutami nowotworów, a także genów kodujących białka związane z błoną komórkową oraz białka podlegających sekrecji. Z punktu widzenia przemysłu farmaceutycznego produkty tych genów stanowią potencjalne obiekty działania środków farmaceutycznych i punkt wyjścia do opracowania nowych terapii. Drugim niezwykle ważnym zastosowaniem mikromacierzy w farmacji jest określanie sposobu działania nowych leków i różnicowanie pomiędzy tymi lekami, które mimo iż kierowane są tych samych białek różnią się efektem działania. Mikromacierze DNA stanowią również narzędzie pomocne w tworzeniu indeksu terapeutycznego i określaniu potencjalnych działań niepożądanych nowych leków [5].


2 . Technologia wytwarzania


Mikromacierze DNA powstają poprzez naniesienie na szklaną lub plastikową powierzchnię zestawu sond (fragmentów DNA o określonej sekwencji), przy czym każda z sond nanoszona jest na podłoże w precyzyjnie określonej lokalizacji. Ze względu na rodzaj i długość sond naniesionych na płytkę możemy wyróżnić mikromacierze cDNA oraz mikromacierze oligonukleotydowe.

2.1 Technologia wytwarzania mikromacierzy cDNA

Mikromacierze cDNA wykorzystują jako sondy długie fragmenty cDNA (od 200 do 600 nuklozydów). Są to najczęściej tzw. krótkie sekwencje ekspresyjne ESTs (ang. expressed sequence tags). Sekwencje takie powstają poprzez izolację odpowiednich transkryptów, syntezę na ich bazie cDNA, a następnie zsekwencjonowaniu końców 3’ i 5’ otrzymanego cDNA [2]. W chwili obecnej istnieją obszerne biblioteki krótkich sekwencji ekspresyjnych, obejmujących EST genów człowieka, a także wielu gatunków roślin i zwierząt.
Jako sondy, w mikromacierzach cDNA można również wykorzystywać fragmenty cDNA otrzymane we własnym laboratorium poprzez izolację mRNA, który następnie poddany jest reakcji odwrotnej transkrypcji. Odpowiednie fragmenty powstałego w ten sposób cDNA można amplifikować z wykorzystaniem PCR. Sondy stosowane w mikromacierzach cDNA syntezowane są najczęściej poza płytką, a następnie nanoszone na nią w ściśle określonej ilości i stężeniu.
Technika mikromacierzy cDNA została opracowana na Uniwersytecie Stanforda. Jej podstawową zaletą jest elastyczność umożliwiająca łatwą modyfikację składu mikromacierzy. Technika ta daje również możliwość badania ekspresji genów bez znajomości ich pełnej sekwencji i ułatwia odkrywanie nowych genów. Stosowanie jako sond długich fragmentów cDNA zmniejsza natomiast ryzyko niespecyficznej hybrydyzacji. Nie bez znaczenia pozostaje również stosunkowo niski koszt produkcji tego typu mikromacierzy i duża dostępność tej technologii, która była szeroko udostępniana przez swoich twórców [16].
Słabą stroną mikromacierzy cDNA jest natomiast fakt, że sondy odpowiadające jednemu genowi umieszczane są najczęściej tylko na jednym polu na mikromacierzy. Istnieje więc prawdopodobieństwo błędu w ocenie ilości transkryptu spowodowanego nierówną hybrydyzacją. W porównaniu z mikromacierzami oligonukleotydowymi trudniejsza jest również standaryzacja otrzymanych danych oraz ich porównywanie pomiędzy różnymi laboratoriami [16].

2.2 Technologia wytwarzania mikromacierzy oligonukleotydowych

Mikromacierze oligonukleotydowe wykorzystują jako sondy krótkie fragmenty DNA o długości od 20 do 70 nukleozydów. Sondy te syntetyzowane są najczęściej in situ (bezpośrednio na płytce), co zapewnia wysoką gęstość mikromacierzy i umożliwia umieszczenie na niewielkiej powierzchni nawet kilkudziesięciu tysięcy sond.
Istnieje kilka technik syntezy sond in situ. Firma Affymetrix (USA) produkująca mikromacierze typu „GeneChip” wykorzystuje do syntezy sond in situ metodę opartą na fotolitografii. Na powierzchnię płytki nanoszona jest warstwa zawierająca substancję światłoczułą, a następnie nakładana jest odpowiednia maska, której zadaniem jest ochrona odpowiednich obszarów płytki przed naświetleniem. Naświetlenie płytki powoduje degradację substancji światłoczułej w obszarach nie chronionych przez maskę. W następnym etapie płytka jest płukana roztworem zawierającym odpowiedni nukleotyd, który zostaje związany w miejscu, w którym światłoczuła emulsja uległa degradacji. Zawarte w roztworze nukleotydy posiadają światłoczułą grupę przyłączoną w sposób, który uniemożliwia związanie kolejnego nukleotydu, dzięki temu cały proces naświetlania odpowiednich obszarów płytki może być powtarzany wielokrotnie [10]. Technika ta pozwala na umieszczenie na jednej mikromacierzy nawet do 6,5 miliona pól (długość boku pola- 5µm) i umieszczenie w obrębie jednego pola około miliona sond o zdefiniowanej sekwencji (np.: GeneChip® Human Mapping 500K Array). Sondy stosowane przez firmę Affymetrix posiadają długość 25 nukleozydów, co znacznie zwiększa ryzyko niespecyficznej hybrydyzacji. Problem ten rozwiązano stosując obok sond podstawowych o sekwencji identycznej z sekwencją danego genu (PM –perfect match) także sondy kontrolne, których sekwencja różni się od sond PM jedną zasadą, położoną w środkowej części sondy (MM – mis match). Wprowadzenie dodatkowych sond pozwoliło nie tylko na ocenę specyficzności hybrydyzacji poprzez porównanie poziomu sygnału pochodzącego z sond PM i MM, ale również zwiększyło czułość mikromacierzy w zakresie oceny zmian poziomu ekspresji genów, charakteryzujących się niskim poziomem transkrypcji [9].
Technikę fotolitografii w produkcji mikromacierzy oligonukleotydowych zastosowała również firma NimbleGen. W tym przypadku jednak, zamiast tradycyjnych masek zastosowano technikę DMD (Digital Micromirrors Device)- system projekcyjny złożony z matrycy miniaturowych, aluminiowych luster, z których każde w zależności od potrzeby może kierować światło poza płytkę lub w jeden określony punkt płytki prowadząc do degradacji przyłączonej do nukleotydu grupy światłoczułej [14]. Mikromacierze wykonywane tą techniką mogą zawierać do 2,1 miliona pól, o boku 13 µm, a stosowane przez NimbleGen sondy mogą posiadać zróżnicowaną długość (od 50 do 75 nukleozydów).
Firma Agilent stosuje natomiast technikę „SurePrint” proces zbliżony do metody drukowania stosowanej w drukarkach atramentowych. Na płytkę w precyzyjnie określonej lokalizacji nanoszone jest określona ilość mieszaniny umożliwiającej przyłączenie tylko pojedynczego nukleotydu. Podstawą tej metody jest zastosowanie fosforamitydów – chemicznie zmodyfikowanych nukleozydów, w których wszystkie miejsca reakcji zostały zablokowane grupami chemicznymi, które mogą być selektywnie usuwane. Proces „nadruku” płytki rozpoczyna się od umieszczenia na specjalnie przygotowanej powierzchni płytki pierwszego nukleozydu i usunięcia chroniącej jego grupę hydroksymetylową 5’ reszty trifenylometylowej. Odsłonięta grupa hydroksymetylowa jest następnie utleniana, co umożliwia przyłączenie kolejnego nukleozydu. Proces ten powtarzany jest wielokrotnie, aż do otrzymania pełnej sekwencji całej grupy sond, których długość wynosi 60 nukleozydów [12]. Gęstość mikromacierzy otrzymanych tą techniką jest znacznie mniejsza, niż mikromacierzy otrzymywanych z wykorzystaniem techniki fotolitografii (pola o boku długości 65 µm).


W ostatnich latach rozpoczęto pracę nad płytkami mikromacierzowymi, w których pomiędzy powierzchnią płytki a oligonukleotydami stosowane są łączniki w postaci dendrymerów – wielkocząsteczkowych polimerów o bardzo regularnie rozgałęzionej strukturze, na powierzchni których rozlokowane są liczne grupy funkcyjne (Rys.1). Do grup funkcyjnych dendrymerów dołączane są następnie sondy oligonukleotydowe, do których może hybrydyzować wyznakowany znacznikiem fluorescencyjnym materiał. Tak przygotowana płytka mikromacierzowa zawiera znacznie więcej sond dla cDNA pojedynczego genu niż płytka standardowa, co znacznie zwiększa intensywność sygnału fluorescencyjnego i czułość systemu. Co więcej tego rodzaju płytki można z powodzeniem regenerować i wykorzystywać wielokrotnie. Do tej pory najlepsze rezultaty uzyskano z zastosowaniem dendrymerów poliamidoaminowych (PAMAM) oraz dendrymerów fosforowych ze rdzeniem cyklotrifosfazenowym (Gc) [4].




Rys.1 Schemat budowy dendrymeru. Zlokalizowane na powierzchni grupy funkcyjne zaznaczono kolorem czerwonym


Podstawową zaletą mikromacierzy oligonukleotydowych jest ich ogromna pojemność umożliwiająca umieszczenie na pojedynczej płytce sond reprezentujących cały genom badanego organizmu. Duża pojemność mikormacierzy pozwala również na umieszczenie sond dla jednego transkryptu w kilku miejscach na powierzchni płytki, co znacznie zmniejsza ryzyko błędu w ocenie ilości transkryptu spowodowanego nierówną hybrydyzacją. Mikromacierze oligonukleotydowe, są jednak zdecydowanie mniej elastycznym narzędziem do prowadzenia badań, ponieważ modyfikacje zestawu sond na tego rodzaju płytkach wiążą się z wysokimi kosztami. Ponadto mikromacierze oligonukleotydowe nie znajdują zastosowania w badaniach poświęconych wykrywaniu nowych genów.

3 Przebieg eksperymentu
3.1 Przygotowanie materiału do hybrydyzacji z płytką mikromacierzową

Sposób przygotowania materiału do hybrydyzacji z płytką mikromacierzową jest zależny od typu przeprowadzanego eksperymentu. Materiał wyjściowy do eksperymentu, którego celem jest porównanie profilu ekspresji genów pomiędzy tkanką badaną, a tkanką kontrolną jest całkowity RNA Na bazie wyizolowanego RNA, w reakcji odwrotnej transkrypcji syntetyzowany jest cDNA. W kolejnym etapie przeprowadzana jest reakcja transkrypcji in vitro w wyniku której powstaje cRNA. Na tym etapie transkrypcji in vitro do cRNA wprowadzane są zmodyfikowane nukleotydy do których dołączone zostały znaczniki fluorescencyjne lub epitopy umożliwiające przyłączenie takich znaczników po etapie hybrydyzacji. Wyznakowany w ten sposób cRNA podlega fragmentacji i hybrydyzacji z płytką mikromacierzową.
Materiałem wyjściowym do eksperymentu, z wykorzystaniem mikroamcierzy SNP całkowity, genomowy DNA, który następnie poddawany jest trawieniu enzymem restrykcyjnym rozpoznającym określoną sekwencję DNA. W wyniku trawienia powstają fragmenty DNA wyposażone w „lepkie końce” do których w reakcji ligacji dołączane są fragmenty DNA o znanej sekwencji zwane adaptorami. Tak przygotowany materiał zostaje namnożony z wykorzystaniem techninki PCR. Reakcja przebiega z wykorzystaniem tylko jednego primera rozpoznającego sekwencję adaptora. Parametry PCR dobrane są w ten sposób, aby preferencyjnie prowadzić do namnożenia fragmentów DNA od 250 do 1000 pz. Namnożony materiał podlega fragmentacji, a końce powstałych fragmentów zostają wyznakowane. Tak przygotowany materiał podlega hybrydyzacji z płytką mikromacierzową.


3.2 Metody znakowania materiału do hybrydyzacji z płytką mikromacierzową


Znakowanie materiału do hybrydyzacji z płytką mikromacierzową przebiega najczęściej według jednego z dwóch wariantów. W wariancie pierwszym do badanego materiału, wprowadzane są w trakcie reakcji syntezy nukleotydy dUTP lub dCTP związane ze znacznikiem fluorescencyjnym (znakowanie bezpośrednie) [19]. Metoda ta umożliwia zastosowanie jednej z dwóch możliwych strategii eksperymentalnych. Pierwsza z nich polega na zastosowaniu jednego znacznika fluorescencyjnego i hybrydyzacji materiału kontrolnego oraz materiału badanego na dwóch osobnych płytkach. Rozwiązanie takie stosowane są głównie przez producentów macierzy oligonukleotydowych (np. Agilent One – Color Microarrays). Druga strategia eksperymentalna wymaga zastosowania dwóch różnych znaczników fluorescencyjnych, ale umożliwia hybrydyzację materiału kontrolnego i materiału badanego na jednej płytce mikromacierzowej (Rys.2) Metoda ta znalazła zastosowanie zwłaszcza w eksperymentach wykorzystujących mikromacierze cDNA, w których porównywanie danych z dwóch różnych płytek może być utrudnione, choć stosowana jest również w mikromacierzach oligonukleotydowych (np. Agilent Two – Color Microarrays). Do bezpośredniego znakowania materiału do hybrydyzacji z płytką mikromacierzową stosowane są najczęściej cyjaninowe znaczniki fluorescencyjne Cy-3 i Cy-5.



Rys.2 Schemat eksperymentu z wykorzystaniem mikromacierzy do analizy zmian poziomu ekspresji genów i bezpośredniej metody znakowania materiału za pomocą dwóch barwników fluorescencyjnych: Cy3 i Cy5


Inną metodą bezpośredniego znakowania materiału jest fragmentacja badanego materiału, a następnie znakowanie jego końców. W tym celu najczęściej wykorzystuje się terminalną transferazę deoksyrybonukleotydową. (TdT), która katalizuje reakcję dołączania znakowanej fluorochromem nukleotydów do końca 3' pofragmentowanego materiału [7]. Metoda ta wykazuje największą efektywność znakowania dla jednoniciowego DNA, można ją jednak wykorzystać również do znakowania dwuniciowego DNA oraz RNA. Taka metoda znakowania materiału stosowana jest między innymi w eksperymentach, wykorzystujących mikromacierze SNP (Rys.3).




Rys.3 Schemat eksperymentu z wykorzystaniem mikromacierzy SNP i bezpośredniej metody znakowania materiału na końcu 3’ za pomocą barwnika fluorescencyjnego: Cy3


Druga metoda znakowania (znakowanie pośrednie) polega na wprowadzaniu do materiału w trakcie jego syntezy amino allilo-NTP lub amino-allilo dNTP. Zawierający zmodyfikowane nukleozydy materiał jest następnie poddawany reakcji hybrydyzacji z płytką mikromacierzową. Po etapie hybrydyzacji dochodzi do wybarwienia zmodyfikowanych nukleotydów cyjaninowym znacznikiem fluorescencyjnym. W reakcji tej bierze udział grupa aminowa zmodyfikowanego nukleozydu, która wiąże się z estrem N-hydroksysukcynimidowym fluorescencyjnego znacznika cyjaninowego [11]. Inną metodą znakowania pośredniego jest wprowadzanie do syntezowanego łańcucha DNA lub RNA biotynylowanych nuklezoydów, które po etapie hybrydyzacji wybarwiane są koniugatem streptawidyny i fikoerytryny [8]. Stosując pośrednią metodę znakowania hybrydyzację materiału kontrolnego oraz materiału eksperymentalnego przeprowadza się na osobnych płytkach (Rys.4).


Rys.4 Schemat eksperymentu z wykorzystaniem mikromacierzy do analizy zmian poziomu ekspresji genów i pośredniej metody znakowania materiału za pomocą biotynylowanych nukleozydów oraz koniugatu streptawidyny i fikoerytryny.

W ostatnich latach coraz większą popularnością cieszy się również technika pośredniego znakowania materiału wykorzystująca dendrymery. DNA. Monomeryczną jednostkę takiego dendrymeru stanowi dwuniciowa helisa DNA zakończona czterema jednoniciowymi ramionami, zaprojektowanymi w ten sposób aby w specyficzny sposób oddziaływały między ze sobą, budując większą strukturę. Na powierzchni struktury do pojedynczych ramion związane zostają dwa rodzaje cząsteczek, z których pierwsze zawierają znacznik fluorescencyjny, drugie natomiast oligonukleotyd o znanej sekwencji [12]. Do badanego materiału wprowadzona zostaje natomiast sekwencja komplementarna do oligonukleotydu związanego na powierzchni dendrymeru. Po hybrydyzacji materiału z płytką mikromacierzową następuje wybarwianie znacznikami dendrymerycznymi, które wiążą się z dodatkową sekwencją i emitują sygnał fluorescencyjny [4].
Do wzmocnienia sygnału fluorescencyjnego emitowanego przez zhybrydyzowany z płytką mikromacierzową materiał wykorzystywane są również dendrony. Jest to szczególny rodzaj dendrymeru o stożkowatym kształcie posiadający jedną „centralną” grupę funkcyjną oraz kilka grup funkcyjnych zlokalizowanych na powierzchni (Rys.5). „Centralna” grupa funkcyjna połączona jest z oligonukleotydem, podczas gdy do pozostałych grup funkcyjnych dołączony jest znacznik fluorescencyjny lub radioaktywny. Dendrony wprowadzane są do znakowanego materiału w reakcji odwrotnej transkrypcji lub PCR [4].




Rys.5 Schemat budowy dendronu. Zlokalizowane na powierzchni grupy funkcyjne zaznaczono kolorem czerwonym, grupę „centralną” – zielonym.




Literatura

1. Abdullah-Sayani A, Bueno-de-Mesquita JM, van de Vijver MJ. Technology Insight: tuning into the genetic orchestra using microarrays—limitations of DNA microarrays in clinical practice (2006) Nature Clinical Practice Oncology 3, 501-516
2. Alba R, Fei Z, Payton P, Liu Y, Moore SL, Debbie P, Cohn J, D’Ascenzo M, Gordon JS,. Rose JKC, Martin M, Tanksley SD, Bouzayen M, Jahn MM, Giovannoni J. ESTs, cDNA microarrays, and gene expression profiling: tools for dissecting plant physiology and development. (2004) Plant J 39; 697–714
3. Altug-Teber Ö, Dufke A, Poths S, Mau-Holzmann UA, Bastepe M, Colleaux L, Cormier-Daire V, Eggermann T, Gillessen-Kaesbach G, Bonin M, Riess O. A rapid microarray based whole genome analysis for detection of uniparental disomy
4. Caminade AM, Padié C, Laurent R, Maraval A, Majoral JP. Uses of Dendrimers for DNA Microarrays. (2006) Sensors 206, 901-914
5. Crowther DJ. Applications of microarrays in the pharmaceutical industry. (2002) Current Opinion in Pharmacology 2,551 – 554
6. Engle LJ, Simpson CL, Landers JE. Using high-throughput SNP technologies to study cancer (2006) Oncogene 25, 1594–1601
7. Guerra CE. Analysis of oligonucleotide microarrays by 3' end labeling using fluorescent nucleotides and terminal transferase (2006) BioTechniques 41, 53-56
8. http://www.affymetrix.com/support/downloads/package_inserts/ivt_labelingkit_insert.pdf
9. http://www.affymetrix.com/support/technical/technotes/25mer_technote.pdf
10. http://www.affymetrix.com/technology/manufacturing/index.affx
11. http://www.ambion.com/techlib/resources/arrays/labeling.html
12. http://www.chem.agilent.com/temp/rad0E946/00000176.PDF
13. http://www.genisphere.com/about_3dna.html
14. http://www.nimblegen.com/technology/manufacture.html
15. Hu DG, Webb G, Hussey N. Aneuploidy detection in single cells using DNA Array-based comparative genomic hybridization (2004) Molecular Human Reproduction 10, 283-289
16. Jarząb B, Gubała E, Lange D. Mikromacierze DNA i profil ekspresji genów raka brodawkowatego tarczycy. (2004) Materiały Zjazdowe IV Konferencja Sekcji Endokrynologii Molekularnej PTE 294 -301
17. Mei R, Galipeau PC, Prass C, Berno A, Ghandour G, Patil N, Wolff RK, Chee MS, Reid BJ, Lockhart DJ. Genome-wide detection of allelic imbalance using human SNPs and high-density DNA arrays (2000) Genome Research 10, 1126-1137
18. Perreten V, Vorlet-Fawer L, Slickers P, Ehricht R, Kuhnert P, Frey J. Microarray-Based Detection of 90 Antibiotic Resistance Genes of Gram-Positive Bacteria (2005) Journal of Clinical Microbiology 43: 2291–2302.
19. Solińska M, Jasińska A, Jackowski G. Technika mikromacierzy DNA w analizie wielkoskalowych zmian ekspresji genów roślinnych w odpowiedzi na zmieniające się warunki środowiskowe. (2004) Post Bioch 50; 371 – 382
20. Wang D, Coscoy L, Zylberberg M, Avila PC, Boushey HA, Ganem D, DeRisi JL. Microarray-based detection and genotyping of viral pathogens (2002) Proceedings of the National Academy of Sciences 99 15687 – 15692
21. Zhou X, Cole SW, Hu S, Wong DTW. Detection of DNA copy number abnormality by microarray expression analysis (2004) Human Genetics 114, 464-467