Abstract:

1. Interferencja RNA – fenomen konserwatywny ewolucyjnie.
2. Praktyczne aspekty techniki interferencji RNA.
3. Interferencja RNA w ochronie przeciwwirusowej.
4. Leki na bazie siRNA- problemy i perspektywy.

Zjawisko interferencji RNA (ang. RNA interference, RNAi) i związany z nim proces wyciszania genów został po raz pierwszy wyjaśniony przez Fire i wsp. w 1998 roku, na podstawie badań nicienia Caenorhabditis elegans [1].

Mechanizm zostaje zapoczątkowany przy pojawieniu się w komórce cząsteczek dwuniciowego RNA (ang. double-stranded RNA, dsRNA) (rycina 1, A). Tego typu cząsteczki nie występują w komórkach w normalnym stanie fizjologicznym, a ich pojawienie się świadczyć może np. o infekcji wirusowej (gdzie często dsRNA stanowi jedną z form nośnika informacji genetycznej). Obecność dsRNA może też być skutkiem aktywności replikacyjnej ruchomych elementów genetycznych (np. transpozonów). W kolejnym etapie interferencji RNA następuje enzymatyczna hydroliza dwuniciowego RNA na mniejsze, nadal dwuniciowe cząsteczki, z których każda ma długość ok. 21 nukleotydów. Cząsteczki te są nazywane są krótkim, inteferencyjnym RNA, siRNA (ang. short, interfering RNA). Za proces hydrolizy odpowiedzialny jest przez enzym zwany Dicer, który stanowi jedną z klas rybonukleazy III i jest białkiem bardzo konserwatywnym ewolucyjnie [2] (ryc. 1, B-C).             Na obu niciach siRNA, na końcu 3’ pozostaje niesparowany jeden nukleotyd, z kolei końce 5’ są ufosforylowane. Następnie siRNA są przyłączane do zależnego od RNA kompleksu wyciszającego RISC (ang. RNA – Induced Silencing Complex), który degraduje sensowną nić RNA w cząsteczce siRNA (ryc. 1, D). Nić antysensowna pozwala natomiast na doprowadzenie kompleksu RISC do docelowej nici mRNA na zasadzie powinowactwa substratowego (jest bowiem komplementarna do docelowego mRNA i pełni rolę „przewodnika”) (ryc. 1 E). W ostatnim etapie procesu RNAi RISC prowadzi hydrolizę całej przyłączonej cząsteczki mRNA [2, 3].

                                                                         Rycina 1. Mechanizm interferencji RNA (RNAi).

Objaśnienia w tekście.

Wykonano na podstawie Novina C.D., Sharp P.A. [3].

Wkrótce po doniesieniu Fire i wsp. obecność mechanizmu RNAi potwierdzono również u innych organizmów, nieraz znacznie oddalonych filogenetycznie, w tym u Drosophila melanogaster, roślin oraz ssaków [praca przeglądowa 4]. Funkcjonowanie i znaczenie interferencji RNA różni się nieco u poszczególnych grup organizmów, mianowicie u nicieni i roślin cząsteczki siRNA mogą dodatkowo podlegać amplifikacji przez enzym – polimerazę RNA zależną od RNA. W ten sposób skuteczność RNAi zostaje zwielokrotniona a ponadto jego działanie ulega rozprzestrzenieniu na tkankę a nawet cały organizm. Jest to istotne, ponieważ zarówno u roślin jak i bezkręgowców mechanizm potranskrypcyjnego wyciszania genów za pośrednictwem siRNA stanowi naturalną ochronę przeciwwirusową [5]. U ssaków także wykazano obecność sprawnego mechanizmu RNAi. Svoboda i wsp. wykazali, że zjawisko wyciszania genów na drodze RNAi u ssaków redukuje m.in. ekspresję endogennych sekwencji o charakterze retrotranspozonów [6]. Dzięki temu organizm jest chroniony przed możliwymi insercjami kopii „śmieciowego DNA” w newralgiczne fragmenty genomu.

Mechanizm RNAi może być wyzwolony również w sposób sztuczny – poprzez podanie do organizmu dwuniciowego RNA. W efekcie takiego postępowania można doprowadzić do wyciszenia ekspresji teoretycznie dowolnego genu, który jest komplementarny do nici antysensownej wprowadzanego dsRNA. Powyższe doświadczenie opisano w pionierskiej pracy Fire i wsp. [1], co stworzyło perspektywy do zastosowania RNAi jako narzędzia w badaniu zależności pomiędzy genotypem (ściślej- transkryptomem) a fenotypem i w konsekwencji funkcjonowaniem organizmu. Równolegle do prac poznawczych podjęto także próby celowego wykorzystania interferencji RNA w zwalczaniu niepożądanych cząstek RNA, np. wirusowych.

Praktyczne aspekty techniki interferencji RNA.

Jak wspomniano wyżej, mechanizm potranskrypcyjnego wyciszania genów za pośrednictwem siRNA stanowi naturalną ochronę przeciwwirusową u roślin i bezkręgowców [5]. U ssaków także wykazano obecność mechanizmu RNAi, mimo że dla ochrony przeciwwirusowej wykształcił się układ immunologiczny działający za pośrednictwem interferonu. Poznanie indukcji mechanizmu RNAi u roślin i bezkręgowców pozwoliło na przeprowadzenie podobnych prób ukierunkowanej inhibicji genów w komórkach ssaków [7]. Doświadczalne wyciszanie genów za pomocą interferencji RNA przeprowadza się skutecznie w warunkach in vitro, jednakże w przypadku komórek ssaków, wprowadzenie długich, (tj. powyżej 30 nukleotydów), cząsteczek RNA wiąże się z wywołaniem niespecyficznej odpowiedzi immunologicznej i aktywacją interferonu [8]. Problem został rozwiązany w 2001 roku, kiedy Elbashir i wsp. udowodnili, że można pominąć etap wprowadzania dwuniciowego RNA (dsRNA) a następnie jego hydrolizy przez kompleks Dicer do formy siRNA. W komórkach ssaków możliwe jest zainicjowanie procesu wyciszania genów poprzez wprowadzenie krótkich cząsteczek siRNA o długości ok. 21 nukleotydów, o ściśle zdefiniowanych parametrach i oczywiście komplementarnych do sekwencji wyciszanego genu. Unika się w ten sposób wywoływania reakcji układu odpornościowego [7]. Na podstawie prac doświadczalnych ustalono optymalne parametry budowy cząstek siRNA oraz ich pozycję w obrębie wyciszanego genu, które warunkują możliwie najlepszy efekt wyciszający. Proponuje się m.in. że długość każdej z nici siRNA powinna mieścić się w granicach 19-25 nukleotydów, udział zasad azotowych tworzących potrójne wiązania wodorowe (cytozyny i guaniny) powinna zawierać się w przedziale 30-52%, na końcach 3’ obu nici wskazana jest obecność symetrycznych dinukleotydów. Szczegółowe parametry opisano w pracy przeglądowej Dyxhoorn i wsp. [9]. Obecnie możliwe jest już projektowanie siRNA dla wybranego genu za pomocą opracowanych algorytmów komputerowych. Przykładem jest program sirna, będący częścią pakietu EMBOSS, z którego korzystał w swoich badaniach autor niniejszego opracowania [10]. Niemal wszyscy autorzy prac doświadczalnych podkreślają jednak, że nawet teoretycznie optymalne siRNA nie zawsze sprawdzają się w uzyskiwaniu zadowalającej inhibicji ekspresji genu. Ma to np. związek z konformacją przestrzenną mRNA i różną dostępnością kompleksu RISC do poszczególnych jego fragmentów.

Jak dotąd, z powodzeniem uzyskiwano w komórkach ssaków ukierunkowane działanie RNAi zarówno względem ekspresji genów na chromosomach [11] jak i genów wirusowych [12-14]. Uzyskanie możliwości wyciszania wybranych i ściśle określonych genów, które pełnią ważne role metaboliczne lub/i mają wpływ na występowanie stanów patologicznych zachęca do zastosowania siRNA w terapii wybranych jednostek chorobowych. Przewiduje się, że technika interferencji RNA może mieć duże znaczenie w leczeniu takich chorób jak nowotwory, cukrzyca [15, 16] oraz niektórych stanów patologicznych, np. otyłości [3].

Interferencja RNA w ochronie przeciwwirusowej.

Obiecującym kierunkiem badań jest zastosowanie techniki RNAi wobec genów pochodzenia wirusowego. Szczególnie dużo doniesień literaturowych dotyczy wirusa ludzkiego niedoboru odporności (HIV) jako przedmiotu inhibicji na drodze RNAi. W badaniach, w których siRNA skierowane były przeciwko genom regulatorowym tat i rev- krytycznym dla replikacji wirusa HIV-1, uzyskano zmniejszenie ilości odpowiednich białek (produktów genu), a w efekcie spadek liczby wytwarzanych wirionów HIV-1 [14]. Podobne, równie korzystne wyniki, uzyskiwano w przypadku umiejscowienia cząsteczek siRNA w innym regionie genomu HIV-1, np. w obrębie genu regulatorowego vif [17], genu gag kodującego białko strukturalne, a także genu kodującego receptor komórkowy CD4, niezbędny do zajścia infekcji HIV-1 [3]. Wirus ludzkiego niedoboru odporności należy do grupy retrowirusów, które posiadają genom zbudowany z RNA. W wyniku unikalnego procesu- odwrotnej transkrypcji- przepisują informację genetyczną na kwas desoksyrybonukleinowy, (DNA), który zostaje zintegrowany z genomowym DNA gospodarza, tworząc formę prowirusową (ryc. 2, A-C). Po okresie latencji, która wyznacza granicę pomiędzy tzw. wczesnym i późnym etapem cyklu namnażania, prowirusy ulegają transkrypcji (wykorzystując w tym procesie komórkowy mechanizm ekspresji genów) i ponownie ich materiał genetyczny przyjmuje formę RNA (ryc. 2, D) [18]. Jak więc można zauważyć, w cyklu namnażania retrowirusów istnieją dwa, oddzielone w czasie etapy, wobec których można zastosować inhibicję poprzez technikę RNAi. Potwierdzono, że zarówno genomowe RNA HIV-1 jak i mRNA, które jest efektem replikacji prowirusa są inhibowane przez mechanizm RNAi [17]. Innym przykładem efektywnego działania RNAi wobec genów wirusowych jest wirus zapalenia wątroby typu C (HCV). Wirus ten stanowi poważny problem w populacji ludzkiej, ponieważ często występuje u nosicieli w postaci latentnej, która nie wykazuje objawów klinicznych.








Osoby zakażone HCV mają znacznie podwyższone ryzyko rozwoju nowotworu wątroby a dodatkowo stanowią rezerwuar wirusa do nowych infekcji w obrębie populacji. Ponieważ HCV posiada genom zbudowany z RNA, może być potencjalnie eliminowany przez mechanizm RNAi. Kilka prac (20, 21) wskazuje na wysoką skuteczność eliminacji replikujących cząstek HCV z komórek (w cytowanych badaniach do 98% komórek zostało pozbawionych replikujących cząstek HCV). Udowodniono przy tym, że w zasadzie wszystkie fragmenty genomu HCV mogą stanowić dobre miejsce docelowe dla cząsteczek siRNA, aczkolwiek wykazano różnice w skuteczności pomiędzy poszczególnymi siRNA. Około połowa spośród badanych siRNA wykazywała co najmniej częściowe wyciszenie genów. Inne badania wskazują na wysoką skuteczność siRNA wobec genu kodującego białko niestrukturalne NS5B (to białko enzymatyczne, polimeraza RNA zależna od RNA, jest kluczowe dla procesu replikacji). Efekt wyciszenia ekspresji NS5B, mierzony za pomocą techniki western-blot, wykazał skuteczność rzędu 90% [22]. Prowadzone są również badania nad zastosowaniem RNAi w aspekcie wirusa zapalenia wątroby typu B (HBV). Wydaje się, że spośród licznych analizowanych organów, wątroba jest szczególnie atrakcyjnym narządem pod względem łatwości wprowadzenia cząsteczek siRNA. Problemy związane ze skutecznym dostarczaniem oligonukleotydów do miejsc docelowych będą omówione w innym miejscu niniejszego artykułu.

Potencjalnym celem antywirusowego działania RNAi w praktyce klinicznej może być również wirus grypy. Mimo, że stanowi on mniejsze ryzyko dla zdrowia i życia pacjentów niż np. HIV lub HCV, to jednak jego szerokie rozprzestrzenienie, zdolność do tworzenia form mutacyjnych i/lub rekombinacyjnych oraz występujące okresowo pandemie skłaniają do poszukiwania nowych leków antywirusowych. Ponadto wirus ten stanowi duże niebezpieczeństwo u osób o obniżonej odporności, np. ludzi starszych, dzieci oraz pacjentów poddawanych terapii immunosupresyjnej. Wirus grypy, podobnie jak HCV, posiada genom zbudowany z RNA, co czyni go podatnym na działanie mechanizmu RNAi. Dodatkowo, w przypadku wirusa grypy nie występuje DNA jako forma magazynowania informacji genetycznej, stąd teoretycznie każdy etap cyklu namnażania wirusa może być inhibowany przez interferencję RNA. Genom wirusa grypy ma budowę segmentową, osiem segmentów genomu koduje w sumie 10 białek, z których każde jest niezbędne dla wytworzenia funkcjonalnych wirionów. Sugeruje się zatem, że użycie mieszaniny różnych siRNA skierowanych przeciwko każdemu z segmentów RNA powinno znacznie zwiększyć skuteczność metody. [23, 24]. W przypadku wirusa grypy nie powinno być też problemów z dostarczeniem cząsteczek siRNA do miejsca docelowego- rezerwuaru wirusa w organizmie. Wirus grypy w sposób naturalny zakaża komórki nabłonkowe górnych dróg oddechowych, dlatego wystarczająco skutecznym sposobem dostarczenia siRNA może być inhalacja. Metoda ta jest prosta, przyjazna dla pacjenta, a jednocześnie może zapewnić duże miejscowe stężenie cząstek siRNA. Wirus grypy posiada wyjątkowo silny potencjał mutacyjny, dlatego cząsteczki siRNA, aby były skuteczne, powinny być zaprojektowane w konserwatywnych fragmentach genomu i stosowane w postaci wspomnianej wyżej mieszaniny różnorodnych siRNA [25].

Wirus wścieklizny został także przeanalizowany pod kątem jego podatności na mechanizm RNAi. W tym przypadku docelowym miejscem dla siRNA była sekwencja kodująca nukleoproteinę (N). W badaniach in vitro wykazano pięciokrotny spadek liczby aktywnych wironów w porównaniu do grupy kontrolnej. Należy pokreślić, że w opisywanej pracy zaprojektowano siRNA w obrębie wysoce konserwatywnego fragmentu genomu, który został ustalony na podstawie porównania 221 sekwencji z bazy danych Genbank. Badania nad mechanizmem RNAi w odniesieniu do wirusa wścieklizny wydają się tym istotniejsze, że nie ma jak dotąd skutecznego środka w zwalczaniu infekcji tym wirusem [26].

Antywirusowy potencjał mechanizmu RNAi jest także wykorzystywany in vitro w odniesieniu do organizmów zwierzęcych, przy czym stosuje się tu zarówno organizmy modelowe jako odpowiedniki infekcji człowieka, jak też swoiste gatunkowo wirusy zwierząt. W tym ostatnim przypadku duże znaczenie mają wirusy świni domowej, z jednej strony powodujące upadki zwierząt i straty ekonomiczne, z drugiej- stanowiące potencjalne zagrożenie w przypadku wdrożenia zabiegów ksenotransplantacji. U zwierząt dopuszcza się możliwość wprowadzenia modyfikacji genetycznych, które pozwalają na syntetyzowanie cząsteczek siRNA bezpośrednio w komórkach, czyniąc je w ten sposób odpornymi na infekcje przez wirusy. Strategię RNAi wprowadzono do inhibicji ekspresji endogennych retrowirusów świni (ang. Porcine Endogenous Retroviruses, PERV). Wirusy te mają szczególne znaczenie w aspekcie ksenotransplantacji, czyli podczas przeszczepiania narządów świni do organizmu człowieka. Badania prowadzone w tym kierunku są obecnie mocno zaawansowane, a istotną przeszkodą w ich zastosowaniu w praktyce klinicznej są właśnie PERV, obecne w organizmie każdej świni i zdolne do infekowania komórek człowieka w warunkach in vitro [27]. Jednym ze sposobów eliminacji PERV z komórek świni może być technika RNAi. Ponieważ PERV należą do grupy retrowirusów (podobnie jak HIV), mechanizm RNAi może teoretycznie działać na dwóch etapach cyklu namnażania wirusa. W badaniach prowadzonych in vitro wykazano wysoką, aczkolwiek nie stuprocentową skuteczność eliminacji cząstek PERV w zakażanych komórkach człowieka. Najwyższą skuteczność posiadały siRNA zlokalizowane w regionie RNA kodującym białko kapsydu gag, eliminując do 18% ( w innych badaniach do 12%) wyjściowej liczby cząsteczek mRNA PERV [19, 28]. Z kolei cząsteczki siRNA zlokalizowane w innych częściach genomu, w tym również w innym rejonie genu gag, posiadały mniejszy efekt działania lub nie wykazywały go wcale [28]. W związku z udowodnieniem inhibicji PERV na drodze RNAi in vitro, naturalną konsekwencją są obecnie próby stworzenia zwierząt transgenicznych, których komórki byłyby zdolne do syntezy siRNA. Prace są obecnie w toku, grupa niemieckich badaczy dokonała transdukcji wektorem lentiwirusowym komórek pierwotnych świni, uzyskując wyciszenie ekspresji PERV in vitro. Te wektory mogą być wykorzystane do transgenezy zwierząt [29].

Wektory lentiwirusowe zastosowano także do syntezy siRNA hamujących ekspresję HIV-1. Mimo obiecujących rezultatów (spadek ekspresji o ponad 90% wg [30]), zastosowanie wektorów retrowirusowych w terapii genowej człowieka wydaje się problematyczne. Zwraca się też uwagę na możliwość autodestrukcji wprowadzanego konstruktu, ponieważ wektory lentiwirusowe mają budowę podobną do HIV-1 i same mogą być przedmiotem degradacji przez kompleks enzymatyczny RISC [30, 31].

Rezultaty badań prowadzonych w warunkach pozaustrojowych są bardzo obiecujące, skłaniają do postrzegania techniki RNAi jako potencjalnego skutecznego środka terapeutycznego. Kolejnym krokiem w kierunku wprowadzenia leków opartych na technice RNAi są badania in vivo. Niestety, wskazują one, że wiele założeń teoretycznych oraz wniosków płynących z badań in vitro nie ma odniesienia przy wprowadzaniu siRNA do organizmu ssaków. Jak wspomniano wyżej, nawet optymalnie zaprojektowane cząsteczki siRNA mogą nie dawać odpowiedniego efektu wyciszającego. Co więcej, mogą one powodować występowanie skutków ubocznych, co zależy np. od sekwencji siRNA, wielkości dawki oraz ewentualnych modyfikacji wprowadzonych w budowie cząsteczki [33]. Podstawowym problemem, z jakim należy się uporać przy wdrażaniu metody, jest skuteczne dostarczenie cząsteczek siRNA do ustroju, a w szczególności- do docelowego miejsca ich działania. Cząsteczki kwasu rybonukleinowego są bardzo labilne, po wprowadzeniu ich do organizmu ulegają szybkiej degradacji na skutek hydrolizy przez nukleazy, wszechobecne w surowicy krwi oraz w komórkach. Kolejną przeszkodę stanowi budowa siRNA. Obie nici siRNA przed podaniem do organizmu muszą ulec hybrydyzacji do formy dwuniciowej, ponieważ tylko taka struktura warunkuje skuteczność działania. Każda z pojedynczych nici siRNA ma masę cząsteczkową około 7000 Da (daltonów). Tak wysoka masa cząsteczkowa i silny ładunek ujemny, jakim charakteryzuje się szkielet nici RNA stanowią dużą przeszkodę w pokonywaniu bariery, jaką stanowią błony komórkowe. Dla porównania- niskocząsteczkowe środki czynne tradycyjnych leków mają masę cząsteczkową około 500-700 Da.

Leki na bazie siRNA- problemy i perspektywy.

W badaniach in vitro opracowano skuteczne techniki transfekcji komórek za pomocą różnych związków, co pozwala na dostarczenie siRNA do wnętrza komórek, a ściślej- do cytoplazmy, gdzie zachodzi mechanizm interferencji RNA. [np. Oligofectamine, Invitrogen ]. Niestety, metody te okazały się niewystarczające w badaniach nad zwierzętami; w tym przypadku konieczne jest wypracowanie nowych metod wprowadzania siRNA do miejsca docelowego w organizmie. W przypadku ssaków korzystniejsze wydaje się podawanie cząsteczek siRNA niż wprowadzanie wektorów syntetyzujących siRNA w komórkach. „Gotowe” siRNA wykazują bowiem mniej efektów ubocznych, są łatwiejsze do wykonania (syntezy) oraz są bezpieczniejsze, ponieważ nie mogą integrować z genomowym DNA. Idealne leki oparte na siRNA powinny spełniać takie warunki, jak: odporność na nukleazy, wydajne przenikanie do wnętrza komórek i uwalnianie substancji czynnej w cytoplazmie, brak reakcji ze strony układu immunologicznego, brak cytotoksyczności oraz powinny ulegać szybkiemu rozkładowi w wątrobie lub nerkach. Korzystne jest podawanie siRNA miejscowo do docelowej tkanki/ organu, ponieważ podawanie ogólnoustrojowe wymaga znacznie wyższych stężeń leku, co z kolei może stymulować reakcję immunologiczną i bardziej obciąża wątrobę oraz nerki [34].

Jak wspomniano wyżej, siRNA jest w organizmie podatne na degradację przez enzymy nukleolityczne obecne zarówno w cytoplazmie komórek jak i w surowicy krwi. Jedna z modyfikacji siRNA polega na kapsułkowaniu w liposomach. Liposomy ponoszą stabilność siRNA w surowicy a jednocześnie pozwalają na ich łatwiejsze wprowadzenie do komórek organizmu na drodze endocytozy. Na biodystrybucję liposomów duży wpływ ma ładunek elektryczny; wykazano, że liposomy kationowe i te o ładunku neutralnym mają odmienne cechy i są wprowadzane do komórek z różną wydajnością [35]. Bardzo obiecujące rezultaty wyciszania genów w warunkach in vivo uzyskano wówczas, gdy siRNA umieszczono w specjalnych liposomach zbudowanych z lipidów kationowych w połączeniu z lipidami o właściwościach fuzjogennych . Całość została pokryta warstwą glikolu polietylenowego. Takie stabilne liposomy (zwane SNALP, skrót angielskiej nazwy Stable-Nucleic-Acid-Lipid-Particle) zostały wykorzystane do skutecznego, długotrwałego wyciszenia replikacji wirusa zapalenia wątroby typu B u myszy. Co ważne, efekt wyciszający (10-cio krotny spadek ilości antygenu anty-HBV), który był obserwowany nawet po 6 tygodniach od podania siRNA, uzyskano przy zastosowaniu niskiej dawki leku (3mg/kg/dobę) [34].

Inna strategia chroniąca RNA przed degradacją nukleolityczną polega na kompleksowaniu siRNA z makrocząsteczkami o ładunku dodatnim. Tworzenie stabilnych kompleksów zachodzi na drodze oddziaływań elektrostatycznych. Jednym z badanych związków jest polietylenoimina (PEI). Związek ten, przy fizjologicznych wartościach pH ma ładunek silnie dodatni i tworzy niekowalencyjne kompleksy zarówno z DNA jak i małymi RNA, w tym siRNA oraz z rybozymami. Utworzone w ten sposób makrocząstki są całkowicie odporne na działanie RNA-zy A z surowicy krwi [36]. Kompleksy siRNA z polietylenoiminą są skuteczne w działaniu przeciwwirusowym, co wykazano na przykładzie wirusa grypy [37]. Oprócz kapsułkowania w liposomach i kompleksowania siRNA wprowadzane są modyfikacje chemiczne w budowie cząsteczek, co także zapewnia wyższą stabilność po podaniu do organizmu. Modyfikacje te to np. połączenia fosfosiarkowe (podstawienie atomu siarki zamiast atomu tlenu w jednej z pozycji w fosforanie), połączenia boranofosforanowe (analogiczne do poprzedniego, lecz z wykorzystaniem atomu boru), „zablokowanie” kwasu nukleinowego przez utworzenie mostka metylenowego pomiędzy atomami węgla w rybozie i wiele innych. Ponieważ jest to zagadnienie bardzo szerokie, nie będzie szczegółowo omawiane w niniejszym opracowaniu. Modyfikacje chemiczne mają na celu zwiększenie stabilności termicznej cząsteczki, zwiększenie odporności na działanie nukleaz, polepszenie przenikania do komórek, uzyskanie powinowactwa do określonych narządów a także wzrost powinowactwa kompleksu RISC do docelowej cząsteczki mRNA (patrz też praca przeglądowa Corey i wsp. [38]).

Celem licznych badań pozaustrojowych oraz in vivo jest, oprócz funkcji poznawczej mechanizmu RNAi, także uzyskanie skutecznych leków pozwalających na inhibicję genów odpowiedzialnych za stany patologiczne oraz genów wirusów patogennych względem człowieka (w mniejszym stopniu również zwierząt gospodarskich). Z danych literaturowych wynika, że w chwili obecnej niektóre preparaty znajdują się już w fazie badań klinicznych. Dotyczy to np. leku przeciwwirusowego ALN RSV01 (firmy Anlylam Pharmaceuticals), którego działanie jest skierowane przeciwko syncytialnemu wirusowi oddechowemu (RSV) człowieka. Inny lek przeciwwirusowy zawierający siRNA, jest wdrażany przez firmę Nastech/Galenea, jego działanie jest skierowane przeciwko wirusowi grypy. W terapii AIDS prowadzone są testy kolejnego leku opartego na mechanizmie RNAi, który został stworzony do terapii białaczki wywołanej infekcją HIV. Lek jest realizacją zupełnie innego konceptu, stanowią go komórki macierzyste, transdukowane wektorem lentiwirusowym, który syntetyzuje siRNA przeciwko HIV. Badania te prowadzi firma Benitech przy współpracy z City of Hope (Kalifornia). Opracowywane są także inne preparaty, których działanie skierowane jest przeciwko genom innym niż pochodzenia wirusowego i stąd nie będą szczegółowo omawiane. Niektóre z nich, jak np. Bevasiranib (Acuity Pharmaceuticals) znajdują się w fazie I i II badań klinicznych.

Piśmiennictwo:

1. Fire A, Xu SQ, Montgomery MK, Kostas SA, Driver SE, Mello CC. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. 1998; Nature 391: 806-811.

2. Ketting RF, Fischer SEJ, Bernstein E, Sijen T, Hannon GJ, Plasterk RHA. Dicer functions in RNA interference and in synthesis of small RNA involved in developmental timing in C. elegans. 2001; Genes Dev 15: 2654-2659.

3. Novina CD, Sharp PA. The RNAi revolution. 2004; Nature 430: 161-164.

4. Hannon GJ. RNA interference. 2002; Nature 418: 244-251.

5. Ding S-W, Li H, Lu R, Li F, Li W-X. RNA-silencing: a conserved antiviral immunity of plants and animals. 2004; Virus Res 102: 109-115.

6. Svoboda P, Stein P, Anger M, Bernstein E, Hannon GJ, Schultza RM. RNAi and expression of retrotransposons MuERV-L and IAP in preimplantation mouse embryos. 2004; Dev Biol 269: 276-285.

7. Elbashir SM, Harborth J, Lendeckel W, Yalcin A, Weber K, Tuschl T. Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells. 2001; Nature 411: 494-498.

8. Elbashir S.M., Lendeckel W., Tuschl T.: RNA interference is mediated by 21-and 22- nucleotide RNAs. 2001; Genes Dev. 15: 188-200.

9. Dykxhoorn DM, Lieberman J. Running Interference: Prospects and Obstacles to Using Small Interfering RNAs as Small Molecule Drugs. 2006; Ann Rev Biomed Engineering 8:15.1-15.26.

10. Rice P, Longden I, Bleasby A. EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite. 2000; Trends Gen 16(6): 276-277.

11. McManus MT, Haines BB, Dillon CP, Whitehurst CE, van Parijs L, Chen J, Sharp P.A. Small Interfering RNA-Mediated Gene Silencing in T Lymphocytes. 2002; J. Immunol 169: 5754-5760.

12. Randall G, Rice CM. Interfering with hepatitis C virus RNA replication. 2004; Virus Res 102: 19-25.

13. Ge Q, Eisen HN, Chen J. Use of siRNAs to prevent and treat influenza virus infection. 2004; Virus Res 102: 37-42.

14. Coburn G.A., Cullen B.R.: Potent and specific inhibition of human immunodeficiency virus type 1 replication by RNA interference. 2002; J Virol 76: 9225-9231.

15. Zhang Y, Boado RJ, Pardridge WM. in vivo knockdown of gene expression in brain cancer with intravenous RNAi in adult rats. 2003; J Gene Med 5: 1039-1045.

16. Bain JR, Schisler JC, Takeuchi K, Newgard CB, Becker TC. An adenovirus vector for efficient RNA interference-mediated suppression of target genes in insulinoma cells and pancreatic islets of langerhans. 2004; Diabetes 53: 2190-2194.

17. Jacque JM, Triques K, Stevenson M. Modulation of HIV-1 replication by RNA interference. 2002; Nature 418: 435-438.

18. Goff PS. Retroviridae: The Retroviruses and Their Replication. W: Knipe DM, Howley PM (Eds.), 2001; Fundamental Virology, 4th ed. Lippincott Williams & Wilkins, Philadephia, 843–912.

19. Machnik G. Molekularna charakterystyka sekwencji endogennych retrowirusów świni (PERV) u zwierząt typowanych do ksenotransplantacji. 2007; Praca Doktorska, Śląska Akademia Medyczna.

20. Yokota T, Iijima S, Kubodera T, Ishii K, Katakai Y, Ageyama N, Yingwei C, Lee Y-J, Unno N, Nishina K, Iwasaki Y, Maki N, Mizusawa H, Akari H. Efficient regulation of viral replication by siRNA in a non-human primate surrogate model for hepatitis C. 2007; Biochem Biophys Res Commun 361(2): 294-300.

21. Randall G, Grakoui A, Rice CM. Clearance of replicating hepatitis C virus replicon RNAs in cell culture by small interfering RNAs. 2003; Proc Natl Acad Sci U.S.A. 100: 235–240.

22. Trejo-Ávila L, Elizondo-González R, del C. Trujillo-Murillo K, Zapata-Benavides P, Rodríguez-Padilla C, Rivas-Estilla AM. Antiviral therapy: Inhibition of Hepatitis C Virus expression by RNA interference directed against the NS5B region of the Viral Genome. 2007; Annals Hepatol 6(3): 174-180.

23. Lamb RA, Krug RM, Orthomyxoviridae: the viruses and their replication. W: Knipe, D.M., Howley, P.M. (Eds.), 2001; Fundamental Virology, 4th ed. Lippincott Williams & Wilkins, Philadephia, pp. 725–770.

24. Ge Q, McManus MT, Nguyen T, et al. RNA interference of influenza virus production by directly targeting mRNA for degradation and indirectly inhibiting all viral RNA transcription. 2003; Proc Natl Acad Sci U S A 100:2718-23.

25. Ge Q, Eisen HN, Chen J. Use of siRNAs to prevent and treat influenza virus infection. 2004; Virus Res 102: 37-42.

26. Brandão PE, Castilho JG, Fahl W, Carnieli Jr P, de Novaes Oliveira R, Macedo CI, Carrieri ML, Kotait I. Short-Interfering RNAs as Antivirals Against Rabies. 2007; Braz J Infect Dis 11(2):224-225.

27. Patience C, Takeuchi Y, Weiss RA. Infection of human cells by an endogenous retrovirus of pigs. 1997; Nat Med 3: 282-286.

28. Karlas A, Kurth R, Denner J. Inhibition of porcine endogenous retroviruses by RNA interference: increasing the safety of xenotransplantation. Virology 2004; 325: 18-23.

29. Dieckhoff B, Karlas A, Hofmann A, et al. Inhibition of porcine endogenous retroviruses (PERVs) in primary porcine cells by RNA interference using lentiviral vectors. Arch Virol 2007; 152(3): 629-634.

30. Hayafune M, Miyano-Kurosaki N, Takaku H, Park W-S. Silencing of HIV-1 Gene Expression by Sirnas in Transduced Cells. 2006; Nucleosides, Nucleotides & Nucleic Acids, 25(7), 795-799.

31. Ter Brake O, Berkhout B. Lentiviral vectors that carry anti-HIV shRNAs: problems and solutions. 2007; J Gen Med 9(9) 743-750.

32. Aigner A. Applications of RNA interference: current state and prospects for siRNA-based strategies in vivo. 2007; Appl Microbiol Biotechnol 76(1): 9-21.

33. Heidel JD, Hu S, Liu XF, Triche TJ, Davis ME. Lack of interferon response in animals to naked siRNAs. 2004; Nat Biotechnol 22:1579–1582.

34. Morrissey DV, Lockridge JA, Shaw L, Blanchard K, Jensen K, Breen W, Hartsough K, Machemer L, Radka S, Jadhav V, Vaish N, Zinnen S, VargeeseC, Bowman K, Shaffer CS, Jeffs LB, Judge A, MacLachlan I, Polisky B. Potent and persistent in vivo anti-HBV activity of chemically modified siRNAs. Nat Biotechnol 2005; 23: 1002-1007.

35. Landen CN Jr, Chavez-Reyes A, Bucana C, Schmandt R, Deavers MT, Lopez-Berestein G, Sood AK. Therapeutic EphA2 gene targeting in vivo using neutral liposomal small interfering RNA delivery. 2005; Cancer Res 65:6910–6918.

36. Urban-Klein B, Werth S, Abuharbeid S, Czubayko F, Aigner A. RNAi-mediated gene-targeting through systemic application of polyethylenimine (PEI)-complexed siRNA in vivo. 2005; Gene Ther 12(5):461-466.

37. Ge Q, Filip L, Bai A, Nguyen T, Eisen HN, Chen J Inhibition of influenza virus production in virus-infected mice by RNA interference. 2004; Proc Natl Acad Sci USA 101:8676–8681.

38. Corey DR. Chemical modification: the key to clinical application of RNA interference? 2007; J Clin Invest 117:3615–3622