Klonowanie a inne źródła komórek macierzystych

Biotechnologia rozwija się w dynamicznym tempie. Każde nowe odkrycie rodzi pytania natury etycznej. Możliwość wykorzystania potencjału embrionalnych komórek macierzystych (human embrionic stem cells – hESC) wywołała dyskusję na temat prymatu zdrowia społeczeństwa nad życiem pojedynczego embrionu. Czy można poświęcić życie jednego embrionu, na przykład zamrożonego, nadliczbowego embrionu po procedurze zapłodnienia in vitro (in vitro fertilization – IVF), by w znaczący sposób wspomóc leczenie chorych na cukrzycę, miażdżycę, chorobę Parkinsona czy chorobę Alzheimera? Odpowiedzi będą różne w zależności od nurtu, jaki reprezentuje zapytana osoba. Personalista powie: "nie", utylitarysta: "tak". Gdy zadamy pytanie o komórki specjalnie zaprogramowane dla nas, do wyleczenia dręczącej nas choroby, na przykład dzięki technice tzw. klonowania terapeutycznego poprzez transfer jądra (somatic cell nuclear transfer – SCNT), odpowiedzi przypuszczalnie rozłożą się w trochę innej proporcji. Od 2006 roku wydaje się, że dylemat ten może zostać rozwiązany. Shinya Yamanaka z Kyoto University na łamach czasopisma "Cell" ogłosił udaną próbę przeprogramowania mysiego fibroblastu w indukowane pluripotentne komórki macierzyste (induced pluripotent stem cells – iPSC).[1]

Badania nad iPSC cieszą się obecnie dużym zainteresowaniem i uzyskują finansowanie. W Stanach Zjednoczonych do tej pory fundusze na komórki macierzyste do celów terapeutycznych były kierowane na technologię SCNT. Do transferu jądra potrzebne są oocyty uzyskiwane w wyniku hiperowulacji u kobiety. Proces ten zaburza naturalny cykl miesięczny i powoduje problemy zdrowotne. Amerykańska Narodowa Akademia Nauk (US National Academy of Science) zabrania wynagradzania finansowego kobiet za dawstwo oocytów do badań naukowych,[2] co może wpłynąć na decyzję Nowojorskiej Fundacji Komórek Macierzystych (New York Stem Cell Fundation – NYSCF) o przekierowaniu funduszy z SCNT na iPSC.[3] Nowa instrukcja prezydenta Obamy dla Narodowych Instytutów Zdrowia (US National Institutes of Health) mówi o przeznaczeniu funduszy państwowych na badania nad technologią iPSC.[4]

Dotychczasowe metody otrzymywania iPSC iPSC powstają w wyniku przeprogramowania komórki somatycznej. W trakcie rozwoju embrionalnego komórki różnicują się w tkanki. Informacja genetyczna ulega zmianom, komórki są programowane do pełnienia określonych funkcji w konkretnych tkankach. Zmiany te polegają głównie na trwałym zablokowaniu fragmentów DNA. W każdej komórce ciała występuje taka sama sekwencja DNA, ale część informacji jest niedostępna do odczytu. Dzieje się tak dzięki mechanizmowi metylacji, czyli procesowi przyłączania grup metylowych (-CH3) do zasad azotowych nukleotydów, szczególnie do cytozyny, czasem do adeniny. Takie przyłączenie powoduje zmianę struktury przestrzennej DNA oraz umożliwia białkom opłaszczanie sekwencji DNA, przez co nie jest ona dostępna dla czynników transkrypcyjnych, i proces ekspresji genu jest zablokowany. U ludzi wzór metylacji jest wymazywany w zygocie i ponownie generowany przed rozpoczęciem gastrulacji. Wzór metylacji jest trwały, to znaczy przekazywany podczas podziału na komórki potomne. Drugi mechanizm polega na deacetylacji histonów, czyli odłączeniu reszt acetylowych z białek, na które "nawinięte" jest DNA – białek histonowych. Histony bez grup acetylowych tworzą z DNA silny kompleks, przez co uniemożliwiają odczyt informacji genetycznej.

Przeprogramowanie komórki polega na odwróceniu procesu programowania. Trzeba zastosować czynniki odwracające proces metylacji oraz deacetylacji. Komórkę można przeprogramować poprzez umieszczenie jej jądra w komórce jajowej lub poprzez połączenie komórki somatycznej z embrionalną komórką macierzystą. Przeprogramowanie jest możliwe, ponieważ oba typy komórek zawierają enzymy pozwalające usunąć reszty metylowe oraz dołączyć grupy acetylowe do histonów. Wiele czynników transkrypcyjnych nasilających odczyt genów działa poprzez aktywację enzymów odpowiedzialnych za acetylację histonów, co powoduje rozluźnienie struktury fragmentu chromosomu i jego udostępnienie do odczytu.[5]

Dokładny mechanizm molekularny tego procesu nie był znany. Przeprowadzono szereg eksperymentów, które pokazały, że do przeprogramowania komórki somatycznej w iPSC wystarczające są 4 czynniki w odpowiedniej kombinacji: aOct4, Sox2, cMyc oraz Klf4.[1] Czynniki wprowadzano za pomocą wektorów wirusowych. Wektory to niewielkie cząsteczki DNA pochodzenie bakteryjnego lub wirusowego służące do przenoszenia fragmentu DNA do genomu gospodarza. W obrębie wektora wirusowego ulokowano geny kodujące czynniki transkrypcyjne. Takimi wektorami infekowano kolejno komórki pochodzące tak z zarodka, jak i z dojrzałej tkanki łącznej myszy. Efektem pracy były kolonie komórkowe o zbliżonej morfologii do embrionalnych komórek macierzystych, zwiększonej acetylacji histonów, zmniejszonej metylacji DNA, dużej aktywności telomerazy. Aby sprawdzić pluripotencję uzyskanych komórek, wszczepiano je podskórnie myszom. Jeśli efekt eksperymentu jest pozytywny, u myszy tworzą się guzy – potworniaki. Udało się uzyskać potworniaki złożone z 3 listków zarodkowych, co świadczy o pluripotencji komórek. Żaden z otrzymanych klonów nie był zdolny do ekspresji markera trofoblastu,[1] czyli nie uzyskano klonu totipotencjalnego.

W 2007 roku James Thomson wraz ze współpracownikami z sukcesem powtórzył procedurę dla komórek ludzkich. Zastosował dwa dodatkowe czynniki (Nanog oraz Lin28), które wzmocniły proces przeprogramowania.[6] Te dwa przełomowe wydarzenia sprawiły, że dziś naukowcy mogą stosować komercyjnie dostępne systemy (zestawy) do przeprowadzenia przeprogramowania komórki. Innowacją są zestawy oparte na systemie jednowektorowym. Geny kodujące czynniki transkrypcyjne są poprzedzielane samotrawiącymi się fragmentami DNA. Są również doniesienia, że wystarczy wprowadzić 3, 2, a nawet 1 czynnik "przeprogramowujący", by otrzymać komórki iPSC.[7] Dużym problemem przy stosowaniu systemu wektorowego jest integracja genomu wirusa z genomem przeprogramowywanych komórek. Obecnie trwają prace nad wektorem, który sam opuszcza komórkę po procesie przeprogramowania (self-cleaning vector).[7]

Kolejnym problemem przy stosowaniu systemów wektorowych jest słabo kontrolowana ekspresja wprowadzonych czynników transkrypcyjnych. Rozwiązaniem może być zastosowanie promotora zależnego od tetracykliny, co oznacza, że można kontrolować aktywność genu poprzez odpowiednią dawkę tego antybiotyku.[8] Innym rozwiązaniem jest opracowanie wektora wykorzystującego bakulowirusy (wirusy, których gospodarzem są owady). Specjalnie opracowany dla komórek ssaczych bakulowirus programuje komórkę bez integracji w jej genom. Metoda bezwektorowa polega na wprowadzeniu specjalnego czynnika wyposażonego w domeny wiążące się z błoną komórkową, który pozwala na przeniknięcie białka potrzebnego w procesie przeprogramowania do wnętrza komórki.[9] Próbuje się też opracować metodę, która nie używa ani genetycznej manipulacji, ani wprowadzania białek. Badane są małe cząsteczki odgrywające rolę w procesie przeprogramowania, takie jak kwas walproinowy, który jest inhibitorem enzymu – deacetylazy histonów. Opracowanie "koktajlu" takich cząsteczek spowodowałoby, że proces uzyskiwania iPSC podlegałby łatwiejszej kontroli i byłby znacznie tańszy.[10]

iPSC mogą się stać doskonałym narzędziem w terapii konkretnego pacjenta lub grupy pacjentów z określoną chorobą (p. wyżej). Mogą być również dobrym modelem do testowania leków przeznaczonych dla określonej grupy ludzi. Obecnie można zamówić zestawy do uzyskiwania iPSC, ale głównie po to, by badać proces przeprogramowania czy analizować efekt tego procesu. Technologia jest obiecująca, ale na razie ma wiele wad. Jeśli proces przeprogramowania odbywa się za pomocą wektorów wirusowych, dochodzi do losowej integracji fragmentów genomu wirusa z genomem komórek ludzkich, co generuje nieprzewidywalną zmienność w sekwencji DNA komórek. Terapia genowa z użyciem techniki wektorowej ujawniła, że może to spowodować transformację nowotworową.[5] Próbuje się opracować nowe systemy pozwalające na przeprogramowanie komórki, ale obecnie metoda wektorowa jest jedyną metodą stosowaną komercyjnie. Proces przeprogramowania z użyciem tego systemu trwa około miesiąca. Jeśli przeprogramowanie odbywa się poprzez fuzję komórek lub transfer jądra, cały proces trwa 24–48 godzin. Im dłuższy proces, tym większe prawdopodobieństwo nagromadzenia niekorzystnych mutacji, więc ryzyko wydaje się znaczne.[7] Do tej pory nie udało się opracować metody, która pozwalałaby na oszacowanie dopuszczalnego progu mutacji, jaki może zawierać komórka wprowadzana do organizmu ludzkiego. Technologia uzyskiwania iPSC jest mało wydajna: na 10 000 komórek poddawanych przemianie, udaje się wytworzyć tylko jedną przeprogramowaną komórkę.[11]

Etyczne pytania w kwestii iPSC

Naukowcy cały czas dążą do tego, by usprawnić proces indukcji komórek pluripotencjalnych. Zwiększają wydajność procesu przeprogramowania za pomocą różnych czynników: sekwencji DNA, białek, małych cząsteczek chemicznych. Proces jest pod pilną obserwacją wielu ośrodków badawczych i firm komercyjnych. Zakładając, że uda się opracować wysoce wydajną metodę, w której nie będzie dochodzić do integracji genomu wektora z genomem uzyskiwanych iPSC, linie komórkowe będą stabilne i pierwsze próby kliniczne wykażą skuteczność leczenia z ich wykorzystaniem – to czy stosowanie tej techniki będzie etycznie dopuszczalne? iPSC charakteryzują się tymi samymi cechami co embrionalne komórki macierzyste, czyli: nie mają warstwy komórek niezbędnych do wytworzenia łożyska, są zbyt małe i nie są totipotentne, czyli nie mogą przekształcić się w cały organizm ludzki.[12] Ich otrzymywanie nie wiąże się z niszczeniem embrionu, dlatego technika ta może się wydawać etycznie dopuszczalna. Wypowiedź Gregory’ego Kaebnicka z Hasting Centre na forum bioetyków13 sugeruje nam ostrożność w fascynacji nową metodą. Uważa on, że iPSC nie różnią się pod względem etycznym od klonów uzyskanych na drodze tzw. klonowania terapeutycznego. Zarówno iPSC, jak i klony nie przekształcą się w człowieka, jeśli się im nie zapewni odpowiednich warunków. iPSC wytwarzają 3 listki zarodkowe, czyli są pluripotentne. Dodanie jednego czy kilku czynników, które sprawiłyby, że będą zdolne do wytworzenia trofoblastu (warstwa komórek odpowiedzialna za wytworzenie łożyska), przekształciłoby je w komórki totipotentne, czyli zdolne do wytworzenia organizmu ludzkiego. Keabnick twierdzi, że jeśli mamy obawy co do tego, że klony mogą się stać człowiekiem, to takie same obawy powinniśmy mieć w stosunku do iPSC.

Procedura wyprowadzania indukowanych pluripotentych komórek macierzystych jest wieloetapowa, ale wprawny laborant może ją przeprowadzić bez większych trudności. Na stronach firm produkujących gotowe zestawy do przeprogramowania można obejrzeć krótkie filmy pokazujące wszystkie etapy procedury. Daleka jest jeszcze droga do tego, by proces ten był szybki, wydajny, powtarzalny i zależny tylko od 1 czy 2 czynników. Jeśli tak się kiedyś stanie, to odpowiedź na pytanie o aspekt etyczny będzie bardzo trudna. Z jednej strony nie jest niszczone życie ludzkie (embrion) i nie wyrządza się szkody innym osobom, a cała procedura ma szczytny cel – pomoc ciężko chorym i ratowanie życia. Z drugiej zaś strony: czy możemy w laboratorium mieć taką władzę, że dodając jakiś czynnik lub nie, tworzymy z komórki somatycznej pełny embrion lub tylko 3 listki zarodkowe? Takich i podobnych pytań nasuwa się wiele. Jedyne, co możemy zrobić dzisiaj, to bacznie obserwować, co się dzieje w tej nowej bardzo fascynującej technologii. Bioetyk opiniujący tę metodę powinien mieć pewność, że iPSC nie przekształcą się w embrion.

Jeden z bioetyków, porównując klonowanie terapeutyczne z klonowaniem reprodukcyjnym, trochę nietrafnie zacytował architekta Ludwiga Meisa van der Rohe: "Bóg tkwi w szczegółach".[14] Znana jest też parafraza tego cytatu: "Diabeł tkwi w szczegółach". W przypadku iPSC szczegóły mają ogromne znaczenie i to one zadecydują o tym, czy metoda będzie etycznie dopuszczalna czy nie.

mgr inż. biotechnologii Małgorzata Chrupek
Zakład Biologii Komórki Instytutu Fizjologii Roślin Polskiej Akademii Nauk w Krakowie
Katedra Biochemii i Biotechnologii Politechniki Rzeszowskiej

Piśmiennictwo
1. Takahashi K., Yamanaka S.: Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell, 2006; 126: 663–676
2. The National Academies: Guidelines for human embryonic stem cell research. http://www.nap.edu/. Za: Dickenson D.: Good science and Good ethics: why we should discourage payment for eggs for stem cell research. Nature Rev. Genetics, 2009; 10. http://www.nature.com/reviews/genetics
3. Dickenson D.: Good science and Good ethics: why we should discourage payment for eggs for stem cell research. Nature Rev. Genetics, 2009; 10. http://www.nature.com/reviews/genetics
4. National Institutes of Health: Guidelines on human stem cell research. http://stemcells.nih.gov/policy/2009guidelines.html/. Za: Dickenson D.: Good science and Good ethics: why we should discourage payment for eggs for stem cell research. Nature Rev. Genetics, 2009; 10. http://www.nature.com/reviews/genetics
5. Sanak M.: Indukowane pluripotentne komórki macierzyste – nadzieja medycyny regeneracyjnej. Med. Prakt., 2008; 3: 161–164
6. Yu J., Hu K., Smuga-Otto K. i wsp.: Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science, 2007; 318. Za: Eisenstein M.: iPSCs: one cell to rule them all? Nature Methods, 2010; 7: 81
7. Eisenstein M.: iPSCs: one cell to rule them all? Nature Methods, 2010; 7: 81–85 8. Yu J., Hu K., Smuga-Otto K. i wsp.: Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences. Science, 2009; 324. Za: Eisenstein M.: iPSCs: One Cell to rule them all? Nature Methods, 2010; 7: 82
9. Zhou H., Wu S., Joo J.Y. i wsp.: Generation of induced pluripotent stem cells using recombinant proteins. Cell Stem Cell, 2009; 4: 383
10. Lin T., Ambasudhan R., Yuan X. i wsp.: A chemical platform for improved induction of human iPscs. Nature Methods, 2009; 6: 805–808
11. Sposób na wytwarzanie etycznych komórek macierzystych. Rzeczpospolita/Rynek Zdrowia. http://www.rynekzdrowia.pl/Badania-i-rozwoj/Sposob-na-wytwarzanie-etycznych-komorek-macierzystych-,12 040,11.html
12. Cohen C.B., Brandhorst B.P.: Getting clear on the ethics of iPS cells. Bioethics forum, http://www.thehastingscenter.org/Bioethicsforum/Post.aspx?id=710&blogid=140
13. Tamże, Readers respond: G. Kaebnick The Hastings Centre
14. McHugh R.: Zygote and "Clonote": the ethical use of embryonic stem cells. N. Engl. J. Med., 2004; 351: 209