Wprowadzenie
Ryzyko zanieczyszczenia rybonukleazami (RNazami) występuje podczas wszystkich doświadczeń przy użyciu RNA. Także w przypadku zastosowania najczystszych technologii istnieje możliwość zanieczyszczenia RNazami, co może mieć istotne skutki dla danych pozyskiwanych w toku dalszych doświadczeń.. Nienaruszony RNA wysokiej jakości jest kluczowym czynnikiem sukcesu wrażliwych aplikacji, takich jak RT-qPCR, testy wiązania białek z RNA, analizy mikromacierzy czy sekwencjonowanie RNA. Rzeczywista wartość predykcyjna tych technologii opiera się na założeniu, że RNA stosowany podczas reakcji odpowiada RNA stosowanemu in vivo. Mimo że oczyszczony RNA może nie zawierać RNaz i być nienaruszony, mogą one zostać wprowadzone w trakcie przetwarzania . RNazy mogą dostać się do laboratorium na wiele sposobów: przez nieosłonięte ręce,otwarte okna lub wentylację. Jednak skutki są zawsze takie same: zdegradowany RNA i nieoptymalny przebieg doświadczeń.
„RNazy mogą dostać się do laboratorium na wiele sposobów, ale skutki są zawsze takie same: zdegradowany RNA i – w konsekwencji – nieoptymalny przebieg doświadczeń.”
Przeprowadziliśmy ewaluację wielu zapasów buforów i wody, stosowanych w laboratoriach naukowych wolnych od RNaz, pod kątem występowania RNaz. Wszystkie próbki zostały wykorzystane do oczyszczenia białek wiążących RNA oraz do wykonania testów enzymatycznych i testów opóźnionej migracji białek RNA w żelu. Oprócz testów określających zanieczyszczenie RNazami oceniliśmy także we wszystkich rodzajach próbek zdolność inhibitora Recombinant RNasin® Ribonuclease Inhibitor (nr kat. N2515) do ochrony RNA przed degradacją spowodowaną RNazami.
Metody
Zarówno ogólnie dostępne, jak i własne (indywidualne) zapasy wody (sterylizowanej w autoklawie Milli-Q® lub komercyjnie dostępnej wody poddanej działaniu DEPC) oraz buforów przeanalizowano pod kątem występowania RNaz. Poddane analizie próbki były wykorzystywane w laboratorium w okresie od 1 do 14 miesięcy przed wykonaniem testu.
W przypadku każdej próbki pobrano 35 µl, które podzielono na dwie podwielokrotności o objętości 17,5 µl. W celu stwierdzenia występowania RNaz w próbkach podczas jednej serii reakcji zbadano próbkę zawierającą podwielokrotność o objętości 17,5 µl, 5 µl nienaruszonego ludzkiego RNA (1 µg/µl, Clontech) oraz 2,5 µl bufora reakcyjnego 10X RNase ONE™ Ribonuclease. Równolegle przeprowadzono inną serię reakcji przy zastosowaniu opisanej powyżej kombinacji próbki/RNA/bufora oraz 1 µl (40 U) inhibitora Recombinant RNasin® Inhibitor. W obu przypadkach przeprowadzono kontrolę negatywną (przy użyciu 17,5 µl wody wolnej od nukleaz (nr kat. P1195), pobranej ze świeżo otwartej butelki zamiast próbki), z inhibitorem Recombinant RNasin® Inhibitori bez tego inhibitora. Wszystkie reakcje zostały poddane nocnej inkubacji w temperaturze 37°C. Patrz rysunek 1, przedstawiający schemat przebiegu doświadczenia.
Rysunek 1. Schemat przebiegu doświadczenia
Wyniki
Siedem z dziewięciu przetestowanych próbek wykazywało różne stopnie zanieczyszczenia RNazami, gdy próbka i RNA były inkubowane bez inhibitora rybonukleazy. Zarówno własne (ścieżki 4, 5, 6 i 9), jak i ogólnie dostępne zapasy (ścieżki 8, 10 i 11) buforów wykazywały zanieczyszczenie RNazami, o czym świadczy degradacja RNA. Próbki 5 oraz 8–11 wykazywały znaczną degradację RNA, co wskazuje na to, że były one poważnie zanieczyszczone RNazami (patrz rysunek 2, panel A).
W przypadku wszystkich przetestowanych próbek RNA pozostał nienaruszony podczas nocnej inkubacji w temperaturze 37°C po dodaniu inhibitora Recombinant RNasin® Ribonuclease Inhibitor (patrz rysunek 2, panel B).
A. Bez inhibitora Recombinant RNasin® Inhibitor
B. Z inhibitorem Recombinant RNasin® Inhibitor
Rysunek 2. Analiza żelowa integralności RNA po inkubacji
Pięć mikrolitrów pobranych z każdej reakcji wymieszano z 4 µl bufora Formaldehyde Sample Buffer (nr kat. Lonza 50571) oraz 2 µl bromku etydyny o stężeniu 0,1 mg/ml. Mieszanki były następnie inkubowane przez 5 minut w temperaturze 65°C. Sześć mikrolitrów każdej mieszanki puszczono na żelu agarozowym o stężeniu 1% z buforem 1X TBE przy 100 V przez około 25 minut.
* - = brak zanieczyszczenia, + = lekkie zanieczyszczenie, ++ = poważne zanieczyszczenie
.jpg)
Tabela 1. Próbki laboratoryjne wykorzystane do elektroforezy przedstawionej na rysunku 2
Wnioski
Zanieczyszczenie RNazami w przetestowanym laboratorium RNA było ewidentne, mimo że było ono oznakowane jako „wolne od RNaz”. Zanieczyszczenie RNazami występowało zarówno w ogólnie dostępnych, jak i wewłasnych zapasach laboratorium. Czyste technologie oraz zastosowanie wody wolnej od nukleaz (nr kat. P1195) są istotne w kontekście zapobiegania zanieczyszczeniom RNazami, mogą być jednak niewystarczające do utrzymania integralności RNA, gdy zanieczyszczone bufory lub woda (zarówno z zapasów ogólnie dostępnych, jak i własnych) są dodawane w toku doświadczeń. Zapasy są szczególnie podatne na zanieczyszczenie, gdy znajdują się w rotacji przez długi okres czasu. Dodanie inhibitora Recombinant RNasin® Ribonuclease Inhibitor ochroniło RNA przed RNazami występującymi we wszystkich próbkach laboratoryjnych podczas inkubacji nocnej w temperaturze 37°C. Poprzednie badania wykazały, że inhibitor RNasin® hamuje działanie RNaz w szerokim zakresie temperatur (4, 25, 37, 50°C) oraz wartościpH (5–8)(1), co umożliwia bardzo dużą elastyczność w planowaniu doświadczeń. Poza tym inhibitor Recombinant RNasin® nie jest izolowany z tkanki ludzkiej, nie zawiera więc śladów ludzkiego DNA(2).Te zalety, w połączeniu z wszechobecnością RNaz, sprawiają, że inhibitor Recombinant RNasin® Ribonuclease Inhibitor należy uznać za niezbędny dodatek do każdej reakcji, w której wykorzystywany jest RNA.
Wiecej informacji na temat produktu na stronie Promega. W aktualnej promocji Promega zapewnia 25% rabatu na RNasin®.
http://www.promega.com/b/pl/rnasin/default.aspx
RNasin jest zastrzeżonym znakiem towarowym firmy Promega. RNase ONE jest znakiem towarowym firmy Promega.
Milli-Q jest zastrzeżonym znakiem towarowym firmy Millipore.
Artykuł dostarczony przez Promega GmbH
KOMENTARZE