Tradycyjne liczenie komórek off-line, zwane również pobieraniem komórek, wiąże się z ekstrakcją komórek z bioreaktora i czasochłonną analizą. Pobieranie komórek to żmudny proces, który niesie ze sobą ryzyko zanieczyszczenia całej partii. Poza tym ręczne pomiary off-line mogą być niedokładne. Gdy ta czasochłonna procedura dobiegnie końca, uzyskane dane prawdopodobnie nie będą już precyzyjnie przedstawiać zawartości bioreaktora, ponieważ procesy w nim zachodzące odbywały się dalej w trakcie trwania analizy. Z wyżej wymienionych powodów ocena gęstości żywotnych komórek on-line daje lepsze rezultaty. Wiąże się ona z mniejszym ryzykiem, a co więcej dostarcza dane w czasie rzeczywistym i pozwala na dokładniejszą analizę i lepsze decyzje.

Kwantyfikacja komórek na mikronośnikach

Zawiesiny komórek są stosunkowo łatwe do analizy, ponieważ komórki nie są połączone ani zakotwiczone. Zwykłe rozcieńczenie wystarczy do przygotowania zawiesiny komórek, jednak analiza komórek przylegających do mikronośnika wymaga znacznego wysiłku.

Mikronośniki mają tę istotną zaletę, że maksymalizują proces hodowli komórek zależnych od zakotwiczenia, jak np. komórki nerek małych chomików (BHK) w bioreaktorach stałej objętości. Kwantyfikacja off-line tych komórek wymaga ich odłączenia od mikronośnika poprzez trypsynizację – proces enzymatyczny, który oddziałuje na fizjologię i żywotność komórki. Pomiary liczby komórek on-line często oparte są na właściwościach optycznych, jak np. absorbancja. Tego typu pomiary nie są kompatybilne z systemem mikronośników, ze względu na znaczną optyczną gęstość oraz właściwości rozpraszające światło mikronośników. Aby jak najlepiej wykorzystać zalety pomiarów on-line oraz rozwój komórek w mikronośnikach, należy stworzyć nowy rodzaj parametru pomiarowego.

Czujnik Incyte firmy Hamilton oparty jest na odczytach przenikalności elektrycznej (pojemność na jednostkę powierzchni). Mierzy on nagromadzony ładunek elektryczny komórki. Sygnał czujnika koreluje z gęstością komórek żywotnych, ponieważ błony martwych komórek nie są szczelne i nie mogą gromadzić ładunku elektrycznego. Mikronośniki nie magazynują ładunku ze zmiennego pola elektrycznego. Poniżej opisano eksperyment pokazujący, jak bardzo precyzyjnie czujnik ten mierzy gęstość komórek żywotnych w hodowlach na mikronośnikach.

Zastosowanie czujnika Incyte

Napowietrzenie i wzbudzenie są bardzo częste w procesie rozwoju komórek. Aby nie dopuścić do ich wpływu na pomiar przenikalności, użyto czujnika Incyte do zmierzenia poziomu rozwoju komórek BHK na mikronośnikach w zakresie typowych parametrów procesu w buforowanej fosforanem soli fizjologicznej (PBS). Wzbudzenie ustawiono na 100 rpm lub 400 rpm i pomiarów dokonywano przez dwie godziny. Nie zaobserwowano znaczącego wpływu wzbudzenia na pomiary. Poziom napowietrzenia wahał się pomiędzy 0,5 l/min i 2 l/min przez jedną i dwie godziny. Również w tym przypadku nie odnotowano istotnego wpływu na pomiar gęstości komórek żywotnych. Dodatkowo eksperyment przeprowadzono również w warunkach kultury na mikronośniku Cytodex (3 g/l) bez obecności komórek. Tu również nie odnotowano żadnego wpływu na odczyt przenikalności, co potwierdziło, że obecność mikronośników nie zaburza odczytów przenikalności.

Pomiary on-line żywotności komórek

Zainicjowano typowy proces hodowli komórek, aby porównać wyniki pomiarów off-line z opartymi na przenikalności pomiarami on-line. Komórki BHK wyhodowano w reaktorze Biostat B 2 L (Sartorius). Objętość kultury wynosiła 1 l, użyto podłoża DMEM, F-12 HAM ze stabilnym źródłem glutaminy oraz 10% dodatkiem płodowej surowicy bydlęcej (FBS). Glutamina jest znanym kodem źródłowym i z tego względu użyto jej jako pożywki.

Warunki hodowli ustawiono na 37 °C, 120 rpm, pH 7,2 i 40% nasycenia tlenem. Mikronośnikiem był Cytodex 3 i użyto go przy gęstości na 3 g/l. W celu zmierzenia przenikalności zainstalowano czujnik Incyte, do dokonania pomiaru użyto częstotliwości 300 kHz i ustawiono częstotliwość tła na 10 MHz (aby uniknąć efektu matrycy). Próbki off-line przeanalizowano za pomocą Nucleo Counter NC100 (ChemoMetec) pod kątem liczby komórek żywotnych oraz wszystkich komórek.

Rysunek 3a. przedstawia porównanie przenikalności (pF/cm) obliczonej on-line oraz liczbę komórek off-line (liczba żywotnych komórek/ml). Jak już wyżej wspomniano, pomiary off-line są podatne na błędy. Tę tendencje przedstawiono graficznie poprzez znaczne standardowe odchylenie w pomiarach on-line. Niemniej jednak całościowa linia trendu (niebieska linia) przebiega bardzo podobnie do linii pomiaru on-line (czerwona linia).

Co ciekawe niewielkie odchylenie znaleziono po 54 godzinach trwania procesu. Jednak to odchylenie nie pasuje ani do przewidywań opartych na wszystkich pomiarach off-line, ani do sygnału on-line. Taka wartość odstająca w rzeczywistym procesie prawdopodobnie doprowadziłaby do błędnej interpretacji rozwoju komórek, co z kolei spowodowałoby błędne decyzje dotyczące pożywki lub zbioru.

Zestawiono ze sobą dane z pomiarów on-line i off-line z całego eksperymentu (Rys. 3b.). Współczynnik determinacji tych danych obliczono na 80,6% ze względu na zmiany heterogeniczności komórek w fazie plateau krzywej wzrostu. Gdy weźmiemy pod uwagę jedynie fazę intensywnego wzrostu, tj. 30-70 godzin (czerwona linia, Rys. 3b.), to współczynnik determinacji obliczono na 99,4%. Należy zauważyć, iż dane z 54. godziny nie zostały użyte do tych zestawień. Ta prawie idealna zgodność pomiarów on-line i off-line w przyszłości pozwoli na przewidywanie gęstości komórek żywotnych opartej na sprawdzaniu przenikalności, zwłaszcza w fazie intensywnego wzrostu. Aby wspomóc pomiary on-line i off-line rozwoju komórek, przy pomocy analizatora Bioprofile 100 Plus (Novo Biochemical) przeanalizowano stężenia glutaminy, amoniaku, glukozy i mleczanu. Zgodnie z przewidywaniami poziomy stężenia glutaminy i glukozy malały w fazie wzrostu komórek. Poziomy mleczanu i amoniaku wzrastały podczas trwania całego eksperymentu (Rys. 3c.). To również zostało przewidziane, ponieważ są to produkty uboczne przemiany materii. Dwa razy (ok. 55. i 70. godziny) konieczne było uzupełnienie glutaminy, by umożliwić dalszy rozwój komórek.

Czujnik Incyte umożliwia pomiary najważniejszego parametru procesowego w kulturze komórek – gęstości komórek żywotnych, nawet w przypadku komórek zależnych od zakotwiczenia na mikronośnikach. Dzięki wykorzystaniu czujnika opartego na przenikalności, możliwa jest analiza gęstości komórek żywotnych ssaków na mikronośnikach w czasie rzeczywistym. Pomiar on-line zmniejsza nieścisłości danych, nakład pracy, zużycie próbek oraz ilość czasu potrzebną na wykonanie analizy. Odnosi się to w szczególności do komórek hodowanych na mikronośnikach, ponieważ czujnik Incyte nie wymaga oddzielania ich od zakotwiczenia. Czujnik Incyte pozwala na rzetelne zrozumienie bioprocesów w czasie rzeczywistym, aby lepiej kontrolować cały proces.

Kontakt:
Łukasz Klimczak, Area Sales Manager Poland,
Tel: 605 65 88 87
E-mail: lklimczak@hamilton.ch