Biotechnologia.pl
łączymy wszystkie strony biobiznesu
Wirtualne klonowanie, czyli jak zaprojektować własny transgeniczny organizm
Od pewnego czasu toczą się zażarte dyskusje pomiędzy przeciwnikami i zwolennikami genetycznie modyfikowanych organizmów. Naukowcy specjalizujący się w biologii molekularnej upatrują dużą szansę w wykorzystaniu zarówno roślin jak i zwierząt hodowlanych do produkcji leków, a dopuszczenie przez FDA do obrotu rynkowego ATrynu – pierwszego leku pozyskiwanego z mleka modyfikowanych genetycznie kóz, spowodowało dynamiczny rozwój badań nad wykorzystaniem zwierząt hodowlanych do produkcji środków terapeutycznych. Proces opracowania modyfikacji genetycznej pozwalającej uzyskać wydajną produkcję substancji biologicznie aktywnej np. w liściach roślin czy mleku zwierząt jest procesem bardzo skomplikowanym. Istnieje jednak możliwość stworzenia własnego „projektu molekularnego” z wykorzystaniem ogólnodostępnych programów i serwisów internetowych. Tak więc do dzieła! Spróbujmy zaplanować np. klonowanie mysiego interferonu gamma (Ifng) z wykorzystaniem wektora pUET3.

Gotowi, do startu, START!

Początkowym etapem klonowania jest namnożenie sekwencji wybranego genu, która potem zostanie wprowadzona do wektora. Najlepszym narzędziem do osiągnięcia tego efektu jest reakcja PCR (Polymerase Chain Reaction). Do przeprowadzenia reakcji PCR niezbędne są startery, czyli krótkie, jednoniciowe syntetyczne sekwencje oligonukleotydowe komplementarne do brzegowych sekwencji matrycy, zapoczątkowujące jej amplifikację. Dobór długości starterów opiera się głównie na ich temperaturze topnienia, która powinna mieścić się w zakresie 50-60°C. Jest to bowiem temperatura optymalna dla przyłączania starterów w reakcji PCR. Zbyt niska temperatura stwarza ryzyko niespecyficznego rozpoznawania sekwencji matrycy przez startery, natomiast zbyt wysoka może doprowadzić do niewydajnego przyłączania się do sekwencji komplementarnej. Aby odpowiednio dobrać startery należy zatem przeprowadzić analizę termodynamiczną. Można do tego wykorzystać program VectorNTI (wersja demo dostępna na stronie: (http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/Products-and-Services/Applications/Cloning/vector-nti-software/vector-nti-advance-software/vector-nti-advance-downloads.html#zero), wybierając opcje tak, jak zaznaczono na rysunku poniżej.


 

W pojawiające się wówczas okno należy wkleić sekwencję potencjalnego startera i sprawdzić jego temperaturę topnienia (Tm). Dobór starterów odbywa się na zasadzie prób i błędów oraz indywidualnego wyczucia, ale zakłada się, że ich długość powinna wynosić około 20 nukleotydów. Jednocześnie należy pamiętać, że muszą mieć zbliżoną temperaturę topnienia. To ułatwi bowiem zaplanowanie profilu termicznego reakcji PCR w dalszym etapie.

 

Wskazane jest również, aby przeanalizować, czy wybrane przez nas startery nie tworzą dimerów i struktur typu „szpilka do włosów”. Można to zrobić w tym samym programie wybierając opcję zaznaczoną czerwoną ramką na rysunku. Ewentualnie powstające struktury drugorzędowe nie powinny mieć wartości energii Gibbsa (dG) niższych niż -10. Zakłada się, że powstawanie struktur wykazujących dG większe od -10 zachodzi z bardzo małą wydajnością i nie zakłóca procesu klonowania. Analogiczną analizę należy wykonać dla obu starterów korzystając z opcji „Analyses‑>Oligo Analyses-> Oligo Duplexes”.

 

Kolejnym krokiem przy doborze starterów jest wykonanie testu ich specyficzności względem referencyjnych sekwencji genomu i transkryptomu. Można to zrobić korzystając z narzędzia Primer-BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/). Na stronie należy w odpowiednich miejscach wkleić sekwencje starterów i zaznaczyć opcje, takie jak organizm, którego sekwencja ma zostać poddana analizie.

 

 

Po kilkudziesięciu sekundach otrzymujemy wynik. Ważne jest, aby serwis nie znalazł potencjalnych produktów o podobnej długości do pożądanego. Ewentualne dłuższe fragmenty materiału genetycznego będą amplifikowane z niewielką wydajnością, a zarówno znacząco krótsze jak i dłuższe produkty można będzie łatwo oddzielić przez elektroforezę na żelu.

 

Przejdź dalej i zobacz jak poprawnie zamplifikować gen!

 

Źródła

Źródło: materiały własne

KOMENTARZE
news

<Listopad 2019>

pnwtśrczptsbnd
28
29
30
31
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
1
Newsletter