Poszczególne typy śmierci komórki, różnią się pod kątem czynników je wywołujących, a także symptomami i objawami. Należy więc wyznaczyć grupę cech przypisywanych, każdemu, konkretnemu rodzajowi śmierci komórki.

Wakuolarna śmierć komórki spotykana jest na różnych etapach rozwoju rośliny. Obecna jest w morfogenezie zarodka, podczas formowania pyłku oraz zalążni. Zjawisko to obserwowano w przypadku tworzenia, a także usuwania tkanek oraz organów w roślinie. VCD odnotowano również jako element procesów starzenia. Śmierć komórki w tym typie może zająć nawet kilka dni. Istnieje pewien schemat przebiegu wakuolarnej śmierci komórki. Początkowo dochodzi do spadku objętości cytoplazmy na rzecz zawartości wakuoli litycznych, w wyniku stopniowego pochłaniania przez nie cytozolu. Następnie, tworzą się specyficzne wpuklenia w tonoplaście. Wówczas dochodzi do fuzji powstałych pęcherzyków z wakuolą. Zachodzi pobieranie i degradacja porcji cytoplazmy w świetle wakuoli. Po zjawiskach tych mają miejsce 2 punkty krytyczne VCD, jest to pęknięcie tonoplastu i uwolnienie hydrolaz, a w konsekwencji zniszczenie całego protoplastu, czasami ze ścianą komórkową. Co ciekawe, ta ścieżka śmierci komórki, w ostatnim etapie, może przebiegać w dwojaki sposób. Mianowicie ściana komórkowa może zostać zdegradowana lub pozostać nienaruszona. Pierwszy przypadek obserwowano przy formowaniu aerenchymy, zjawisku perforacji liści oraz w czasie starzenia się płatków korony kwiatowej. Ściana komórkowa pozostaje natomiast nietknięta w przypadku VCD zachodzącej przy dyferencjacji komórek ksylemu oraz podczas remodelingu zachodzącego w liściach. Wakuolarnej śmierci komórki mogą towarzyszyć też inne objawy. Są to: destabilizacja cytoszkieletu komórki poprzez demontaż aktyny i otoczki jądrowej. Opisywano również występowanie segmentacji jądra komórkowego. Często obserwowany był brak zmian w organellach komórkowych do momentu pęknięcia tonoplastu. Ten typ śmierci komórki roślinnej stanowi pewien kontrast dla funkcjonowania lizosomów zwierzęcych. U roślin bowiem, wakuole lityczne biorą udział w procesie recyclingu części komórek w czasie normalnego rozwoju i wzrostu lub podczas poddawania roślin stresom odżywczym. Jeżeli chodzi o podłoże genetyczne VCD, liczne prace donoszą o istnieniu genu ATG, który ujawnił się np. u Arabidopsis, podczas przyspieszania starzenia liści. Natomiast gen ATG5 jest uznawany za wymagany, by doszło do procesu wakuolarnej śmierci komórki u rzodkiewnika. Podsumowując, VCD jest śmiercią komórki, podczas której zawartość protoplastu usuwana jest na drodze procesu podobnego do autofagii, w wyniku uwolnienia hydrolaz z wakuoli litycznych.

Kolejnym, z rodzajów śmierci komórki jest śmierć nekrotyczna, zwana również katastrofą bioenergetyczną, powstałą w rezultacie wyczerpania zasobów ATP. NCD pojawia się typowo, gdy roślina zostanie poddana stresom abiotycznym, np. dojdzie do zniszczenia mechanicznego, lub roślina będzie pod wpływem czynników chemicznych, toksyn. Nekrotyczna śmierć komórki pojawia się również, kiedy dojdzie do rozpoznania patogena przez roślinę. Ten dość powolnie przebiegający proces, uznawany jest przez część autorów za niekontrolowaną odpowiedź rośliny. Wskazania na bierny charakter tego procesu stworzono na podstawie badań, w których NCD występowała podczas stresów tak silnych, że nie dochodziło do możliwości uruchomienia innych typów śmierci komórki, tych, uznawanych za kontrolowane. Odnotowano również występowanie nekrotycznej śmierci komórki jako procesu zupełnie przypadkowego. Na podstawie obserwacji opisanych w licznych artykułach, można wyszczególnić objawy charakterystyczne dla tego rodzaju śmierci komórki. Należą do nich: obrzęk mitochondriów i niewłaściwa osmoregulacja. Dochodzi wtedy do napływu jonów i wody do środka komórki, a to w konsekwencji prowadzi do pęcznienia protoplastu. Ostatni, wymieniony symptom jest najbardziej charakterystycznym i najłatwiej wykrywalnym. W trakcie nekrotycznej śmierci komórki zaobserwowano także rozszerzenie ER oraz szybkie pękanie błony komórkowej, co jest rezultatem naprężeń, jakie powstają w wyniku naporu nadmiernie wypełnionego protoplastu. W wyniku przerwania ciągłości błony komórkowej dochodzi do wylania zawartości komórki. Należy zaznaczyć, że w przypadku NCD nie ma miejsca „czyszczenie” przy pomocy enzymów wakuolarnych, komórki pozostają nieprzetworzone. Aby doszło do rozpoznania NCD należy przeprowadzić analizę obrazów spod mikroskopu elektronowego oraz zbadać zmianę przepuszczalności błon mitochondrialnych. Ważnym elementem, potwierdzającym wystąpienie nekrotycznej śmierci komórki jest określenie zużycia tlenu i ATP oraz zbadanie akumulacji ROS i RNS.

Nekroza, inaczej martwica, to śmierć komórki powstająca jako rezultat uszkodzenia komórek bodźcami zewnętrznymi i obejmuje zwykle całe grupy komórek. Czynniki, które wywołują to zjawisko przeciwdziałają odporności komórki. Do elementów indukujących NCD należą: promieniowanie UV oraz jonizujące oraz skrajne temperatury. Pod ich wpływem zostaje zaburzony prawidłowy bilans osmotyczny, ponieważ do środka komórki napływają jony. Co ważne, komórka nie jest w stanie wytwarzać energii. Zaistniałe zmiany są nieodwracalne, a śmierć komórki nie może zostać przerwana.

U roślin wyróżnia się zjawisko nekrozy, indukowanej stresem abiotycznym lub rozpoznaniem patogena w reakcjiHR,w przypadku ataku nekrotrofa. Niektórzy autorzy sugerują jednak, iż niszczenie komórek podczas reakcji nadwrażliwości zachodzi dzięki programowanej śmierci komórki, na drodze makroautofagii. Symptomy makroautofagii, tj. pojawienie się autofagosomów, odnotowano w komórkach, jakie zostały zaatakowane przez patogeniczny mikroorganizm oraz w komórkach sąsiadujących. Za przypisaniem HR do śmierci na drodze autofagii, świadczy fakt ograniczenia działalności patogena w tkance, dzięki przeprowadzonemu samotrawieniu komórek zainfekowanych.

Reakcja nadwrażliwości, jak w/w, ma miejsce podczas rozpoznania patogena przez roślinę. Towarzyszą jej objawy NCD, czasem VCD. W drugim przypadku nie dochodzi jednak do wyczyszczenia zawartości komórki. HR może być poprzedzona objawami makroautofagicznymi, jeżeli ogranicza się do niewielu komórek. Charakterystycznym dla niej objawem jest wyładowanie białek obronnych poza protoplast, jeżeli bakteria bytuje w apoplaście.

Kolejnym sposobem przejścia komórki na drogę całkowitego unieczynnienia, jest programowana śmierć komórki. Wśród PCD wyróżnia się niekiedy DCD, czyli programowaną śmierć komórki, występującą w trakcie rozwoju rośliny oraz programowaną śmierć komórki powstałą w odpowiedzi na bodźce sygnalizacyjne. Czynnikami sygnałowymi mogą być w tym przypadku fitohormony, kwas giberelinowy, etylen, kwas salicylowy, czy kwas jasmonowy. Niezależnie od typu PCD, stwierdzono, że jest to zachodzący poprzez mechanizmy molekularne i fizjologiczne, program obumierania. Polega on na aktywnych procesach eliminacji składników komórki i prowadzi do śmierci komórki poprzez zniszczenie jej protoplastu. Częstymi jego objawami są fragmentacja chromatyny oraz degradacja jądra komórkowego. Co należy podkreślić, PCD jest ściśle regulowana genetycznie i niesie ze sobą istotne znaczenie. Programowana śmierć komórki warunkuje prawidłowe formowanie zarodka podczas embriogenezy (tapetum, wieszadełko, bielmo). Ważną rolą, jaką odgrywa, jest regulacja histogenezy, np. w przypadku aerenchymy i członów naczyń ksylemu. Ponadto bierze udział w utrzymywaniu homeostazy w tkankach. PCD ma swój udział w formowaniu organów roślinnych, ale również w starzeniu i obumieraniu fragmentów roślin.

Godnym uwagi typem śmierci, występujących w komórkach roślinnych jest apoptozo-podobna śmierć komórki. Została ona wyróżniona jako oddzielny rodzaj programowanej śmierci komórki ponieważ u roślin nie występuje typowa apoptoza. Są tego 3 powody. Po pierwsze: komórki roślinne otacza sztywna ściana komórkowa, której obecność wyklucza tworzenie ciał apoptotycznych. Po drugie: ściana komórkowa jest przeszkodą, uniemożliwiającą wchłonięcie przez komórki sąsiadujące pozostałości po zdegradowanej komórce. Po trzecie: nie istnieją roślinne komórki fagocytujące. Tym niemniej, w przypadku badań na roślinach, udokumentowano formowanie ciał podobnych do apoptotycznych, wykazano istnienie białek kaspazopodobnych i analogicznych genów zaangażowanych w opisywany proces. W kulturach zawiesinowych, w których indukowano PCD, wyróżniono cechy apoptozy, takie jak: uwolnienie cytochromu c, zagęszczenie chromatyny czy degradację DNA. Al-PCD opisano jako osobny proces, który przebiega dość szybko, tzn. ok. 6h. Jest on odpowiedzią komórki na cząsteczki sygnałowe lub regulację genową. Zbadano, że wpływ na apoptozo-podobną śmierć komórki roślinnej mają inhibitory kaspaz. Al-PCD jest wysoce regulowana, odwracalna do końca drugiego, spośród 3 wymienianych jej stadiów, analogicznych do etapów apoptozy. Istnieją pewne markery, dzięki którym można odróżnić występowanie tego typu śmierci komórki, od np. NCD. Markerem takim może być brak fluorescencji FDA i towarzysząca jej kondensacja cytoplazmy. To pozwala na stwierdzenie, że komórka jest martwa i przeszła drogę Al-PCD, w odróżnieniu od przebytej NCD. W jej przypadku przy braku fluorescencji występuje też brak wycofania cytoplazmy. Drugim markerem jest obraz rozpadu DNA na żelu agarozowym po przeprowadzonej elektroforezie. Forma drabinki świadczy o przebytej Al-PCD, w odróżnieniu od NCD, o której świadczy forma plam.

Najbardziej interesującym typem śmierci komórki jest autofagia. Proces ten polega na trawieniu przez komórkę jej własnych struktur, stąd inna nazwa: samotrawienie. Autofagia występuje powszechnie zarówno u roślin, jak i grzybów, odnajdywane jest także u zwierząt. Ta śmierć komórkowa występuje przy niedoborze składników pokarmowych. Często degradacja struktur w jednej komórce zachodzi po to, by produkty jej rozpadu wzięły udział w syntezie składników innych komórek organizmu. Należy zaznaczyć, że pojawienie się autofagii w 1 komórce nie świadczy o jej obecności, ani nie powoduje jej przebiegu w komórkach sąsiednich. Ten rodzaj śmierci komórki odgrywa liczne role w organizmie roślinnym, tj. zachowuje równowagę pomiędzy biosyntezą a rozkładem cząsteczek. Zjawisko to, jeśli dojdzie do jego odwrócenia, stanowi sposób na przetrwanie komórki w czasie niedoboru składników odżywczych. Autofagia jest przede wszystkim ścieżką degradacji części komórki, prowadzącą do jej śmierci. Posiada kilka cech charakterystycznych. Są to: nagromadzenie autofagosomów, wakuolizacja cytoplazmy oraz brak uporządkowanych zmian w organizacji chromatyny. Do charakterystycznych symptomów autofagii należy zaliczyć specyficzne struktury, jakie występują tylko w tym typie śmierci komórki. Pierwszym z takich tworów jest wakuola lityczna. Pełni ona najważniejszą rolę podczas opisywanego procesu. Wykryto różny jej skład w różnych komórkach. Tworzona jest ona w wyniku gromadzenia enzymów hydrolitycznych w soku wakuolarnym. Część białek wakuoli litycznej odpowiada za właściwości tonoplastu, część za formowanie kolejnych, charakterystycznych dla autofagii struktur, jakimi są autofagosomy. Te ostatnie to pęcherzyki, otoczone podwójną błoną. Czasem są one włączane do wakuoli. Wyróżniany został też inny rodzaj pęcherzyków, pęcherzyki błonowe (PPV), nazywane również pęcherzykami prekursorów proteaz. Ich funkcja polega na transportowaniu enzymów VPE, saspaz i metakaspaz, enzymów kodowanych przez genom jądrowy. Wspomniane VPE, są to enzymy przetwarzające, które dostarczane są do wakuoli z cytoplazmy w formie nieaktywnej. Ich aktywacja zachodzi pod wpływem kwaśnego pH wakuoli. Związki te odpowiadają za aktywację białek potrzebnych do mechanizmu destrukcyjnego. Opisywane enzymy uważane są za roślinne odpowiedniki kaspaz, czyli białek regulacyjnych.

Autofagia jest najczęstszym typem PCD, zachodzącym u roślin. Jest ona niezwykle ważnym procesem, biorącym udział we wzroście i rozwoju organizmów roślinnych. Zwykle zachodzi bez degradacji ściany komórkowej, a to pozwala na tworzenie sieci, które pełnią funkcję szkieletu roślinnego. Usuwanie struktur, które spełniły swoje funkcje, również zachodzi na ścieżce autofagicznej.

Niektórzy autorzy w ramach autofagii wyszczególniają 3 jej podtypy: mikro-, makro- i megautofagię. Spotykane są też sugestie, że są to 3 etapy autofagii, które jednak nie zawsze występują w komplecie. Opinia ta oparta jest na badaniach, które ukazały wystąpienie w komórkach 1 i 2 typu autofagii, czasami po ich odbyciu występował typ 3.

Pierwszy z podtypów to proces przebiegający w ten sposób, że mały fragment cytoplazmy zostaje włączony do wakuoli poprzez wgłębienie tonoplastu. W rezultacie tego zdarzenia powstaje wewnątrzwakuolarny pęcherzyk, inaczej zwany ciałem autofagowym. Następnie dochodzi do trawienia błony go otaczającej i uwolnienia jego zawartości w soku wakuolarnym.

Makroautofagia jest procesem wysoce konserwatywnym. W czasie jej trwania dochodzi do włączania do wakuoli litycznej dużego fragmentu cytoplazmy, który najczęściej zawiera w sobie organella komórkowe. Określono pewien schemat przebiegu tego podtypu autofagii. Najpierw dochodzi do tworzenia tzw. PAS. Jest to otwarta struktura przedautofagowa z ER. Służy ona do zamknięcia w części cytozolu dzięki połączeniu ze sobą końców tworu, a to w konsekwencji prowadzi do powstania autofagosomu. Następnie ma miejsce zespolenie zewnętrznej błony autofagosomu z tonoplastem. Struktura, która została pozbawiona w ten sposób zewnętrznej błony, kieruje się do wewnątrz wakuoli i otoczona jedną, pozostałą błoną, nazywana jest ciałem autofagowym. Ostatnim etapem makroautofagii jest strawienie ciała autofagowego wraz z zawartością. Niektóre badania sugerują, iż istnieją przypadki, gdy trawienie zawartości autofagosomu w wakuoli litycznej jest poprzedzone przyłączeniem struktur komórkowych, które przypominają lizosomy lub endosomy. Ma wówczas miejsce początkowe stadium degradacji protein. Do analizy wystąpienia makroautofagii w roślinach wykorzystuje się metodę oznaczania białek ATG8 występujących w autofagosomach za pomocą GFP.

Rys. 1. Schemat powstawania autofagosomu.

Megaautofagia natomiast, przebiega odmiennie. Początkowo dochodzi do intensywnej produkcji enzymów hydrolitycznych oraz ma miejsce lokowanie proteaz serynowych i cysteinowych, endonukleaz, lipaz i kwaśnych fosfataz wewnątrz wakuoli komórkowej. Ma to swój rezultat w powiększaniu objętości wakuoli. W końcu dochodzi ona do takiej wielkości, że zajmuje prawie całą komórkę. Następnie dochodzi do zmian w przepuszczalności tonoplastu, a w konsekwencji do uwolnienia nagromadzonych enzymów. Finalnie, ma miejsce degradacja wszystkich struktur komórkowych. Megaautofagia występuje wyłącznie u roślin i jest dla nich kluczowa. Jej obecność odkryto w czasie formowania aerenchymy i elementów sitowych floemu. Dzięki niej dochodzi do tworzenia tapetum pylników oraz przeprowadzania ksylogenezy. Zamierające w w/w sposób komórki mogą pełnić funkcje ochronne, np. komórki czapeczki korzenia.

Izabela Kołodziejczyk