Naukowcy z Uniwersytetu w Teksasie opracowali system CALI, który umożliwia badanie funkcji białek, poprzez ich uszkodzenie (utratę funkcji). System ten jest doskonalą alternatywą do tradycyjnych technik proteomiki funkcjonalnej takich jak technologia RNAi czy genetyczny „knockout” białek. CALI łączy zalety tych technologii i dodaje następne: pełną kontrolę nad tym kiedy, gdzie i jakie białko zostanie uszkodzone. Technika CALI (ang. Chromofore-Assisted Light Inactivation), czyli inaktywacja światłem za pośrednictwem chromoforu bazuje na destrukcyjnych właściwościach jednej z form tlenu: tlen singletowy. Zasada działania systemu jest podobna jak w przypadku fotodynamicznej terapii (PDT) stosowanej w nowotworach. W obu przypadkach do układu podaje się specjalne znaczniki połączone z chromoforami. Zadaniem znaczników jest odszukanie właściwego fragmentu tkanki w organizmie (in vivo, PDT) lub konkretnego białka (jak dotąd tylko in vitro, CALI). Z kolei do chromoforów należy zaabsorbowanie dużej ilości energii pochodzącej z naświetlania, a następnie wykorzystanie jej do konwersji tlenu z jego stanu podstawowego (trypletowego) to niezwykle reaktywnego tlenu singletowego. Tlen singletowy to bardzo silny kwas Lewisa, który natychmiastowo utlenia wszystko co znajdzie się w pobliżu. W ten sposób w technice PDT (ang. PhotoDynamic Therapy) naświetlenie światłem o niskiej energii-podczerwonym (w tym zakresie organizm człowieka wypromieniowuje ciepło) powoduje dosłowne wypalenie fragmentu chorej tkanki, natomiast w technice CALI prowadzi do uszkodzenia znaczonego białka, bezpowrotnej utraty jego funkcji. Autorzy pracy opracowali wydajny system CALI z użyciem zmutowanej dehalogenazy haloalaknów (fluorowcopochodne alkanów) – białko HaloTag (HPT). Natywna forma tego enzymu katalizuje hydrolizę halogenków alkilowych do odpowiadających im alkoholi, poprzez utworzenie intermediatu jakim jest estrowy kompleks substrat-enzym. Mutacja w centrum aktywnym dehalogenazy (His272 do Phy) prowadzi do zahamowania reakcji na etapie kowalencyjnego intermediatu – enzym nie jest w stanie zhydrolizować wiązania estrowego kompleksu. Z tego względu mutant HPT jest doskonałym łącznikiem pomiędzy docelowym białkiem, które ma ulec inaktywacji, a halogenopochodnym chromoforem (chromofor + HaloTag), który służy jako wysokoenergetyczna platforma do konwersji trypletowego O2 do destrukcyjnego singletowego O2. W celu prześledzenia wydajności systemu CALI opartego na HPT, naukowcy, metodami inżynierii genetycznej połączyli zmutowaną dehalogenazę (HPT) z lucyferazą – białkiem naturalnie przejawiającym chemiluminescencje (sprawny układ powinien charakteryzować się jak najsłabszym świeceniem pochodzącym od uszkodzonej lucyferazy). Z drugiej strony przygotowano chromofor – kompleks [Ru(bpy)3]2+ z dołączonym HaloTag (Ru-HT, czyli halogenopochodną kompleksu tris-(2,2’-bipirydylo)ruten (II)). Dodanie Ru-HT do obecnej w układzie fuzji HPT-Luc prowadzi do kowalencyjnego połączenia komponentów systemu CALI: Ru-HT-HPT-Luc. Następnie wzbudzony światłem chromofor [Ru(bpy)3]2+ powoduje wydajną konwersję tlenu trypletowego do tlenu singletowego który uszkadza lucyferazę powodując tym samym mierzalny spadek chemiluminescencji w układzie. Powyższe doświadczenie przeprowadzane były in vitro w ekstrakcie komórek Hela. Jednakże potwierdzono również zdolność przenikania kompleksu chromoforu Ru-HT przez błony komórkowe, jak i brak ubocznych skutków związanych ze stosowaniem połączeń rutenu i krótkotrwałego naświetlania na komórki żywe. Dane te sugerują możliwość wykorzystania techniki CALI nie tylko in vitro ale również in vivo podobnie jak w przypadku wspomnianej na początku fotodynamicznej terapii PDT powszechnie stosowanej w walce z nowotworami


Mol Biosyst 2008, 4:59-65