Jak wygląda praca nad opracowaniem testu diagnostycznego wykorzystującego technikę Real Time PCR?

Przede wszystkim należy zacząć od analizy sekwencji DNA, co jest chyba najtrudniejszym etapem badań. Trzeba poświęcić dużo czasu na przestudiowanie bazy danych sekwencji, aby znaleźć tę odpowiednią, czyli taką, która jest unikalna tylko dla danego patogenu. Diagnosta musi mieć pewność, że to co wykrył za pomocą testu jest daną jednostką chorobową. Następnie, po dokładnym sprawdzeniu unikalności sekwencji, trzeba zaprojektować odpowiedni układ reakcyjny – dobrać odpowiednie sekwencje sond, starterów, kontrolę wewnętrzną. Później, po zamówieniu odczynników, następuje etap pracy laboratoryjnej - optymalizacja warunków reakcji i na koniec walidacja zestawu diagnostycznego.

Na czym polega próba wewnętrzna?

Do przeprowadzenia reakcji potrzeba dwóch elementów: testu diagnostycznego ze wszystkimi składnikami potrzebnymi do wykrycia danej sekwencji patogenu oraz preparatu DNA, który  został uzyskany z próbki pobranej od pacjenta. Może to być próbka moczu, krwi, wycinek tkanki, wymaz lub kał. Problem polega czasami na tym, że ta próbka DNA może być niewłaściwej jakości – może być za dużo materiału genetycznego lub próbka może zawierać substancje hamujące reakcję PCR. To spowoduje otrzymanie fałszywie negatywnego wyniku, ponieważ reakcja nie zajdzie, mimo obecności patogenu. Nasze testy są przed tym zabezpieczone, gdyż zawierają dodatkową, wewnętrzną reakcję na inny układ starterów, wykrywaną w zupełnie osobnym kanale detekcji. Ta reakcja zachodzi, kiedy próbka DNA jest prawidłowej jakości. Jeśli próbka jest źle przygotowana, jest jej za dużo lub zawiera inhibitory reakcji PCR, kontrola wewnętrzna daje wynik negatywny. Wtedy diagnosta jest świadomy, że otrzymany wynik negatywny związany jest z niewłaściwym przygotowaniem preparatu DNA i musi zmienić coś tak, aby uniknąć problemów przy amplifikacji. Wiele laboratoriów ma opracowane własne metody diagnostyczne, np. oparte na tradycyjnej technice PCR, które nie zawierają kontroli wewnętrznej. Moim zdaniem wiele reakcji, które dały ujemny wynik, mogło być spowodowanych właśnie niewłaściwą ilością lub jakością użytego DNA, co doprowadziło do problemów przy amplifikacji i niewykrycia patogenu.

Czy zatem można stworzyć test diagnostyczny „szyty na miarę”? Czy są trudniejsze i łatwiejsze do stworzenia testy diagnostyczne?

Jeżeli jest to jednostka chorobowa, do której można przypisać unikalną sekwencję DNA, to można stworzyć test diagnostyczny bez większych problemów. Mogą to być choroby genetyczne, może to być badanie różnych polimorfizmów, a nawet choroby nowotworowe, w których stwierdza się zmiany na poziomie DNA, czy na poziomie ekspresji genów. Wykrywać można wszelkie choroby zakaźne: wirusowe, bakteryjne, pasożytnicze, gdzie również mamy do czynienia z organizmami posiadającymi unikalne sekwencje DNA. Natomiast jeśli są to choroby polegające na zmianach w strukturze białek czy w metabolizmie komórkowym, to niestety DNA nie jest tutaj dobrym materiałem do analizy.

Opracowują Państwo testy diagnostyczne dla zwierząt, a dlaczego nie dla ludzi? Czy w przyszłości przewidujecie taką możliwość?

 Wiele zestawów, które posiadamy, może być stosowanych w medycynie człowieka, np. te służące do wykrywania chorób odkleszczowych – Borrelia, Anaplasma, Babesia, po uzyskaniu odpowiednich certyfikatów i zezwoleń. Tak naprawdę działamy głównie na rynku weterynaryjnym głównie z powodu  wiele niższych kosztów wejścia na ten rynek. Z pewnością nie wykluczamy możliwości prowadzenia testów dla ludzi w przyszłości, szczególnie jeśli pojawi się inwestor, który mógłby wyłożyć pieniądze na rejestrację takich testów. W tej chwili zestawy diagnostyczne oparte na technice Real Time PCR są standardem przy diagnozowaniu wielu groźnych chorób człowieka.  Każda próbka krwi oddana w polskiej placówce krwiodawstwa jest obligatoryjnie badana na obecność wirusów HBV, HCV, HIV właśnie przy użyciu tej metody.

W czym taki test genetyczny jest lepszy od tradycyjnej metody wykrywania chorób u zwierząt czy też patogenów w  próbach środowiskowych? Na pewno nie jest to tańsza alternatywa.

Ta metoda przede wszystkim wykrywa bezpośrednio obecność patogenu, dzięki czemu od razu uzyskujemy pewność, że jest on obecny u diagnozowanego pacjenta. W przypadku innych metod, takich jak ELISA, opartych na analizie przeciwciał, wynik już nie jest tak wiarygodny. Może to być spowodowane sytuacją, w której patogen jest obecny w organizmie, a jednak czas infekcji nie jest wystarczająco długi i nie spowodował on wytworzenia przeciwciał. Może być też tak, że organizm jest osłabiony i nie wytwarza przeciwciał, mimo rozwoju choroby. Kolejny fałszywy wynik można otrzymać w sytuacji, kiedy patogen już dawno opuścił organizm pacjenta, ale w krwi krążą jeszcze przeciwciała, ponieważ niekiedy utrzymują się one latami po zakończeniu choroby.

Czy taki test jest nieomylny?

Trudno powiedzieć, czy jest nieomylny. Każda metoda ma jakieś ograniczenia. Tutaj są one stosunkowo nieduże, ponieważ testy diagnostyczne są w stanie wykrywać nawet pojedyncze cząsteczki DNA czy RNA. Jeżeli dobierze się odpowiednią sekwencję DNA, to można mieć pewność, że wynik jest wiarygodny. Myślę, że głównym ograniczeniem jest nie tyle sama analiza, ale dobór odpowiedniego materiału do badań. Na przykład w przypadku boreliozy, kiedy pobierze się próbkę krwi w nieodpowiednim czasie, można otrzymać negatywny wynik, ponieważ patogen może zagnieździć się już w jakimś organie i nie być obecny we krwi.

Firma istnieje od niedawna. Czy trudno było wprowadzić taką ofertę na rynek?

Taki test musi być przechowywany w -20 stopniach Celsjusza, transportowany w suchym lodzie. Jest to dosyć kosztowne i znacznie podnosi cenę takiego zestawu sprowadzanego z zagranicy, dlatego cenowo wychodzimy korzystnie. Jednak rynek diagnostyki opiera się na zaufaniu. Laboratoriom zależy na zaufaniu swoich klientów, stąd zależy im na pozyskiwaniu testów i odczynników od zaufanych i znanych firm. Staramy się ich przekonać, że nasze testy działają porównywalnie do tych już im znanych i wysyłamy próbki zestawów, aby diagności przekonali się o tym osobiście.

PCR w czasie rzeczywistym to znana metoda, a jednak nie jest często stosowana w diagnostyce. Dlaczego?

RT PCR nie jest żadną nowością nauce, ale okazuje się, że stosunkowo niewielka ilość specjalistów potrafi tę technikę prawidłowo stosować i z nią pracować. Urządzeń do Real Time PCR jest coraz więcej na polskim rynku, natomiast brakuje osób, które potrafią zaprojektować reakcję, wykonać ją i przeanalizować jej wyniki. Może to wynika z tego, że w weterynarii królują ciągle tradycyjne metody – ELISA, posiewy mikrobiologiczne lub tylko „zwykły” PCR. Barierą była i chyba ciągle jest kwestia finansowa – koszt urządzeń jest dosyć wysoki. Także cena zestawu diagnostycznego nie należy do najniższych. Jednak warto zainwestować w zakup sprzętu do Real Time PCR, ponieważ stosowanie tej techniki z pewnością podniesie jakość wykonywanych usług, a także skróci czas analizy i zmniejszy ilość pracy potrzebnej do jej wykonania.

Testy diagnostyczne firmy Amplicon dostały nagrodę za Innowację Roku 2014. Na czym polega ich innowacyjność ?

Są to zestawy przeznaczone do wykrywania patogenów wirusowych i bakteryjnych oparte na technice analizy sekwencji DNA. Obecnie jesteśmy jedyną firmą w Polsce, która tego typu testy oferuje i, co ważniejsze, sama opracowuje. Takie testy są dostępne w naszym kraju, ale dostarczane są przez dystrybutorów zagranicznych firm. Jeżeli chodzi o projektowanie i sprzedaż zestawów diagnostycznych opartych na technice Real Time PCR, w tej chwili jesteśmy wyjątkiem na polskim rynku.

Z czym, oprócz opracowywania takich testów diagnostycznych, należy kojarzyć firmę Amplicon?

W tej chwili współpracujemy z Uniwersytetem Wrocławskim, z Wydziałem Nauk Biologicznych i pomagamy przy realizacji projektu badającego obecność patogenów odkleszczowych w dziko żyjących zwierzętach. Staramy się rozpropagować technikę Real Time PCR poprzez organizowanie profesjonalnych szkoleń. Pracujemy nad ofertą testów diagnostycznych wykrywających obecność organizmów modyfikowanych genetycznie. Są one również oparte na technice Real Time PCR. Ponieważ jest to technika ilościowa, te testy będą mogły sprawdzać, czy żywność zawiera domieszki organizmów GM (genetycznie modyfikowanych). Polskie prawodawstwo zezwala na ich ilość nie przekraczającą 5 procent i jeśli jest ich więcej, należy to zaznaczyć na opakowaniu. Drugim zastosowaniem takich testów będzie wykrywanie ziaren GM (genetycznie modyfikowanych), a ponieważ w tej kwestii również polskie prawo przewiduje pewne obostrzenia, myślę że polscy rolnicy chcieliby sprawdzić kupione ziarno. Planujemy także  zdobyć w przyszłości  rynek centralnej i wschodniej Europy.

Aleksandra Kowalczyk