Jedną z metod wykorzystywanych w terapii genowej[1] jest knockout genomowy uzyskiwany dzięki przesunięciu ramki odczytu i dzięki temu kodowanie nieaktywnego białka. Wykorzystywane jest to m.in. w chorobie Huntingtona w celu eliminacji zmutowanego allelu kodującego huntingtynę.

Możliwa jest także indukowana rekombinacja homologiczna[1] - matrycą jest wprowadzony gen egzogenny, który następnie po rekombinacji z uszkodzonym genem jest wstanie przywrócić funkcję kodowanego białka.

Innym rozwiązaniem [1] jest umieszczenie na obu końcach wstawki sekwencji komplementarnej do miejsc w genomie przez nas pożądanych, aby następnie przy pomocy wymuszonej rekombinacji homologicznej doszło do wstawienia naszego genu w miejsce uszkodzonego.

Wyzwaniem dotyczącym terapii genowej jest skuteczne dostarczenie materiału genetycznego do komórki oraz zapewnienie skutecznej rekombinacji w DNA gospodarza, aby uzyskać wbudowanie dostarczanego genu w odpowiednim miejscu.

Zastosowanie w medycynie mają dwie metody terapeutyczne [1]. Pierwszą z nich jest autologiczna terapia ex vivo polegająca na pobraniu komórek pacjenta, które są następnie modyfikowane poza ciałem pacjenta. Komórki, których transformacja przebiegła pomyślnie są następnie wprowadzane ponownie do ciała pacjenta.

Innym podejściem jest terapia in vivo, w której komórki są transformowane bezpośrednio w ciele pacjenta najczęściej przy pomocy wektorów wirusowych lub odkrytej w ostatnich latach metody CRISPR/CAS9, dzięki której powstaje coraz więcej nowych badań dotyczących terapii genowej.

Metoda ex vivo znajduje zastosowanie w terapii przeciwwirusowej, której celem jest zapobieganie wnikania oraz replikacji wirusa w komórce [1]. Najbardziej interesującą i zarazem zaawansowaną metodą jest modyfikacja limfocytów T w terapii przeciw wirusowi HIV, który aby przedostać się do komórki potrzebuje wiązania [2] w zależności od typu wirusa z receptorem CCR5 (wirus HIV typu R5), z receptorem CXCR4 (wirus HIV typu X4) lub przy użyciu obu receptorów (wirus HIV typu X4R5). Jednakże wraz z czasem trwania infekcji zaczyna najczęściej dominować typ R5. Wykorzystywane jest to w badaniach nad zastosowaniem terapii genowej przy użyciu techniki knockout dla genu kodującego receptor CCR5. Dzięki temu jesteśmy wstanie zahamować rozprzestrzenianie się wirusa w organizmie oraz obserwujemy wzrost populacji limfocytów T CD4, które są celem wirusa HIV.

Prowadzone są także badania nad zastosowaniem edycji genów w celu eliminacji innych wirusów jak np. wirusa zapalenia wątroby typu B, wirusa opryszczki czy wirusa brodawczaka ludzkiego. W tym przypadku podejmowane są starania obejmujące usunięcie genomu wirusa z komórki gospodarza przy pomocy degradacji. Niestety jest to niezwykle trudne ze względu na łatwość mutacji zachodzących w genach wirusowych.

Terapia genowa jest także używana w immunoterapii nowotworów [1]. Podobnie jak w poprzednim przypadku celem modyfikacji są limfocyty T, które modyfikuje się ex vivo, tak aby rozpoznawały antygeny nowotworowe i następnie wprowadzane są do komórek gospodarza. Taka strategia jest skuteczna w leczeniu  części przypadków chłoniaków (chłoniaka typu B), białaczek oraz czerniaków. W celu zastosowania zmodyfikowanych komórek jako przeszczepu allogenicznego bez ryzyka odrzucenia, stosowany jest knockout antygenów ludzkich leukocytów (HLA), dzięki czemu przeszczepione komórki nie są wykrywane jako obce.

Podejmowane są także próby [1] uzyskania limfocytów T z wyciszonym genem kodującym receptor glukokortykoidowy, w celu zachowania ich funkcji podczas terapii immunosupresyjnej z zastosowaniem hormonów steroidowych np. po operacyjnym leczeniu glejaka.

Innym przykładem zastosowania terapii genowej jest leczenie dzieci z ciężkim złożonym niedoborem odporności spowodowanym niedoborem deaminazy adenozyny (ADA-SCID). W kolejnych badaniach wraz z doskonaleniem techniki edycji genów w hematopoetycznych komórkach macierzystych oraz pluripotencjalnych komórkach macierzystych były możliwe leczenie innych zaburzeń m.in. anemii sierpowatej, której powodem jest mutacja punktowa E6V geny beta-globiny, a także β-talasemi czy niedokrwistości Fanconiego.

W terapii genowej szerokie zastosowanie ma także metoda in vivo [1], dzięki której m.in. przywrócono syntezę prawidłowego IX czynnika krzepnięcia krwi, odpowiadającego za hemofilię B.

Dokonano tego przy użyciu jako nośnika wektorów wirusa AAV. Natomiast w celu wprowadzenia prawidłowego genu do genomu gospodarza, użyto specjalnie przygotowanej nukleazy palca cynkowego (ZFN). Dzięki tym badaniom staje się możliwe także leczenie innych zaburzeń takich jak hemofilia A, choroby Fabry`ego, Gauchera, Pompego czy zespołów Hurlera i Huntera.

Ciekawym przykładem są także próby wyciszenia genu PCSK9 odpowiadającego w wątrobie za obniżony metabolizm cholesterolu LDL poprzez wzmożoną degradację receptora lipoprotein o niskiej gęstości (LDLR).

Prowadzone są również badania [1,3] mające na celu przywrócenie funkcjonalnego białka dystrofiny odpowiedzialnego za dystrofię mięśniową Duchenne’a. Wykorzystywanych jest kilka strategii: dostarczenie antysensownych nukleotydów, w celu indukcji ekspresji genu dystrofiny, dostarczenie zminiaturyzowanej wersji dystrofiny tzw. „mikrodystrofiny” ze względu na ograniczoną długość genu, który możemy dostarczyć za pomocą wirusa AAV oraz dostarczenie genów mogących zrekompensować brak dystrofiny. Uzyskane wyniki badań są bardzo obiecujące, po wstrzyknięciu do mięśni zrekombinowanego AAV uzyskano ekspresję dystrofiny u zwierząt, obecnie trwają badania kliniczne na ludziach.

Innym przykładem są próby naprawy genu kodującego kolagen typu VII, który jest odpowiedzialny za jeden z rodzajów pęcherzowego oddzielania się naskórka.

Interesujące są także próby leczenia chorób oczu [1,5,6] m.in. wrodzonej ślepoty Lebera, pierwotnej jaskry otwartego kąta, barwnikowego zwyrodnienia siatkówki czy rozwarstwienia siatkówki sprzężonego z chromosomem X. 

Bardzo obiecujące są wyniki badań na myszach, w których udało się przywrócić funkcję genu CFTR kodującego kanały chlorkowe i odpowiedzialnego za rozwój mukowiscydozy.

Dzięki coraz lepszemu poznaniu molekularnych mechanizmów chorób serca możliwe stały się także badania [4] nad zastosowaniem terapii genowej w dysfunkcji mięśnia sercowego, której celem jest wpływ na funkcję  pompy retikulum endoplazmatycznego - Ca 2+ ATPazy (SERCA2a). Do transferu genów użyto rekombinowanego wirusa AAV1 zawierającego gen SERCA2a (AAV1.SERCA2a). Obserwacje są bardzo obiecujące, ponieważ wykazano poprawę i stabilizację na podstawie klasyfikacji NYHA, MLWHFQ, 6MWT, a także VO2max oraz stężenia NT-proBNP i objętości późno-skurczowej lewej komory serca po 12 miesiącach. Ponadto zaobserwowano mniej zdarzeń sercowo naczyniowych po 12 miesiącach w stosunku do placebo. Aktualnie prowadzone są dalsze badania kliniczne nad zastosowaniem wspomnianej metody.

Poza terapią genową ludzi bada się także użycie techniki edycji genomu w celu eliminacji genów oporności na antybiotyki w bakterii, aby możliwe było wyleczenie ciężkich zakażeń bakteryjnych spowodowanych przez wielooporne szczepy.

Podsumowując, terapia genowa w ostatnich latach wykonała olbrzymi krok do przodu dzięki ciągłemu ulepszaniu technik wprowadzania materiału genetycznego. Edycja genów staje się narzędziem, które jest coraz szerzej wykorzystywane w celu opracowywania nowych terapii uciążliwych chorób. Niestety wciąż nieznana jest do końca reakcja układu immunologicznego na wprowadzenie zmodyfikowanych genów. Poza tym potrzebne są także lepsze metody dostarczania terapeutycznych genów do komórek, ponieważ nad szeroko wykorzystywanymi wirusami ciężko jest zapanować oraz wyeliminować całkowicie wbudowywanie się genów wirusowych do komórek gospodarza.

Łukasz Głowacki