Szybkie, nieinwazyjne pipetowanie aktywnych białek

W laboratorium dr. Kevina Phillipsa z Baylor College of Medicine w Houston w Teksasie prowadzone są badania nad receptorem hormonu tarczycy (TR) oraz rolą, jaką odgrywa on w metabolizmie. Receptor TR jest w szczególności zaangażowany w utrzymanie równowagi między procesami magazynowania energii (pod postacią tłuszczu) oraz jej utraty (pod postacią ciepła). Szczegółowe poznanie jego struktury i funkcji, a także innych czynników sygnalizacyjnych tarczycy umożliwiłoby badaczom zaprojektowanie ukierunkowanych interwencji farmakologicznych, łagodzących skutki nadwagi, do których zaliczają się otyłość i cukrzyca typu II. Prowadzone badania nad TR wymagają dużych ilości funkcjonalnych białek, wytwarzanych metodą in vitro. Aby możliwe było przeprowadzenie analiz struktury lub aktywności, białka muszą być poddane procesowi renaturacji do pierwotnej postaci, zaś stosowany w tym celu proces regularnie wymaga poważnych udoskonaleń.

Badacze z tego laboratorium opracowali niedawno wysokowydajną metodę optymalizowania renaturacji białek. Posługując się metodą różnicowej fluorymetrii skaningowej (DSF), wykonują oni analizę nazwaną renaturacją białka kierowaną przez DSF (w skrócie DGR), w której do pomiaru stabilności białek używa się zjawiska fluorescencji. Analiza DGR obejmuje równoległą ocenę wielu parametrów eksperymentu, tak więc na podstawie jej wyników można określić, jakie warunki zapewnią największe prawdopodobieństwo wytworzenia stabilnie zrenaturowanych funkcjonalnych białek. Aby wyniki były dokładne, analiza DGR musi być przygotowana szybko i starannie. Mark Lee, technik z laboratorium Phillipsa, wskazuje dwie potencjalne pułapki. Po pierwsze, sprawdzenie wielu warunków renaturacji, szczególnie w przypadku korzystania z płytek 384-komorowych, wymaga dozowania odczynników z najwyższą precyzją i dokładnością. Po drugie, kluczową rolę w analizie DGR odgrywa fluorescencja, do uzyskania której używa się światłoczułego związku Sypro Orange. Mark Lee opisał próby, które podejmowano w laboratorium w celu usprawnienia przebiegu eksperymentu. Użycie pipety jednokanałowej z płytką 96-komorową zajmowało 10 minut, a z uwagi na słabnący sygnał Sypro Orange uniemożliwiało uzyskanie spójnych wyników. Wydajność poprawiła się, gdy sięgnięto po pipety wielokanałowe, jednak powodowały one u operatorów zmęczenie oraz groziły nawracającymi urazami i nadwyrężeniami. Badacze mieli wątpliwości, co do powtarzalnej objętości, zasysanej przez poszczególne końcówki i obawiali się straty próbek, gdyby końcówka spadła z pipety. Mark Lee rozmawiał z przedstawicielem Rainin Mettler Toledo na temat możliwych rozwiązań. Pracownicy laboratorium znali już pipety jednokanałowe Rainin oraz technologię LiteTouch™ (LTS™). Zdecydowano się wypróbować pipety wielokanałowe LTS. Natychmiast zauważono, że urządzenia LTS zapewniały wyższy komfort pipetowania i wysokiej jakości dane. Zyskawszy pewność, że urządzenia Rainin poprawią przepustowość i jakość danych oraz zmniejszą ryzyko urazów, laboratorium firmy Phillips zakupiło 12-kanałowe pipety 0,5-10 μL, 5-50 μL oraz 20-200 μL, co przyniosło znakomite rezultaty.

Renaturacja kierowana przez DSF pozwala zidentyfikować stabilne konfiguracje białek. Aby poddać białko analizie DGR, rozpuszcza się je w środku chaotropowym, takim jak mocznik, a następnie podzielone na porcje umieszcza na płytce 96- lub 384-komorowej z buforami o różnej wartości pH. W komorach mogą się także znajdować jony w różnych stężeniach. Następnie za pomocą DSF określa się zestaw warunków, w których powstaje najbardziej stabilne zrenaturowane białko, czyli takie, które cechuje się najwyższą temperaturą topnienia. Odsiewając nieoptymalne warunki renaturacji, badacze są w stanie szybko rozpoznać natywne struktury i scharakteryzować je dokładniej na potrzeby dalszych eksperymentów.

Tekst: Mettler Toledo, Marketing, Dział Laboratoryjny