Podobieństwo przede wszystkim!

Jedną z metod repozycjonowania leków bazujących na danych pochodzących z badań ekspresji genów jest komputerowa analiza podobieństwa profili molekularnych. Powszechnie wiadomym jest, że podanie związku biologicznie czynnego powoduje wywołanie zmian w organizmie. Zmiany te wynikają z mechanizmu działania związku (mechanism of action, MOA). Mimo, że mechanizmy działania nie są dokładnie poznane w przypadku wielu związków, to wysokorozdzielcze molekularne techniki pomiarowe mogą być wykorzystywane do badania i oceny całkowitej aktywności molekularnej związku w układzie biologicznym. W ten sposób możliwe jest skonstruowanie „znaczników” aktywności chemoterapeutyków działających w organizmie na poziomie molekularnym. „Znacznikami” tymi są zmiany profili ekspresji genów. Uzyskane dane można następnie porównać z sytuacjami występującymi w określonych stanach chorobowych. Umożliwia to wytypowanie potencjalnych substancji aktywnych w określonym wskazaniu, nawet jeżeli mechanizm działania leku lub jego target nie jest do końca znany.

CMap, czyli co ze sobą powiązać?

Podejście CMap stanowi jedną z pierwszych prób całościowego spojrzenia na dane transkryptomiki i jest jednocześnie jednym z najbardziej wszechstronnych i systematycznych podejść wykorzystujących badania aktywności molekularnej do repozycjonowania leków. Metody polegające na tworzeniu map połączeń (CMap) bazują bowiem na informacjach o zmianie ekspresji charakterystycznych genów w określonych stanach chorobowych. Analizując te zmiany bada się szlaki sygnalizacyjne, które mogą być rozregulowane w danym schorzeniu. Z tymi informacjami zestawia się dane o ekspresji  genów pochodzących z hodowli ludzkich komórek traktowanych substancjami biologicznie czynnymi. Opracowane algorytmy pozawalają na odkrycie powiązań funkcjonalnych między chorobami a lekami, poprzez analizę tymczasowych zmian ekspresji określonych genów. Pożądane są zatem substancje aktywne, dla których obserwowana jest silna ujemna korelacja między profilami ekspresji genów wywołanych ich działaniem, a markerami choroby. Idąc dalej tym tropem, bazując na znajomości leków stosowanych w określonych schorzeniach i znajomości mechanizmów chorób, możliwe jest wytypowanie leków stosowanych w leczeniu jednego schorzenia do badań w innych zastosowaniach.

Aktualnie najprężniej działającą grupą w zakresie badań CMap są naukowcy z Broad Institute, którzy stworzyli bazę danych zawierającą profile transkrypcji genomu jednej lub większej ilości linii komórkowych po podaniu ponad 1309 różnych związków chemicznych. Do pomiarów wykorzystano głównie komórki najczęściej występujących nowotworów, a profil każdego leku zawiera dane o zmianie aktywności transkrypcyjnej każdego genu po ekspozycji na lek. Profile te mogą być wykorzystane jako podstawa do łączenia leków między sobą, jak i leków z chorobami, w oparciu o wspólną aktywność molekularną. Baza danych umożliwia zatem również analizę uzyskanych profili ekspresji z genami znacznikowymi charakterystycznymi dla określonych schorzeń. W tym celu wykorzystywane są metody bazujące na statystyce Kolmogorov-Smirnov.

Metoda ta nie jest oczywiście idealna. Należy pamiętać, że zmiany ekspresji genów w komórkach hodowanych in vitro mogą nie odzwierciedlać dokładnie zmian zachodzących w ludzkim organizmie w stanach chorobowych. Równocześnie nie ma możliwości optymalizacji dawki dla każdego związku. Mimo to naukowcy pracujący z wykorzystaniem map połączeń mogą poszczycić się szeregiem osiągnięć. Schemat postępowania prowadzący do każdego z nich był analogiczny. Poszukiwanie substancji aktywnej w leczeniu określonego schorzenia prowadziło do opracowania profilu ekspresji genów charakterystycznych dla choroby. Następnie, z wykorzystaniem CMap analizowano związki wykazujące silną negatywną korelację z markerami choroby. Później związki te badano na dostępnych modelach. Korzystając z metod CMap odkryto, na przykład, możliwość zastosowania cymetydyny, powszechnie znanej jako lek na chorobę wrzodową żołądka, w terapii raka płuc. Badania na komórkach gruczolakoraka płuc A549 w warunkach in vitro, jak i w postaci ksenoprzeszczepu u myszy wykazały redukcję ich wzrostu pod wpływem działania związku. 

Baza CMap stwarza również możliwość analizy połączeń nie tylko między chorobami a lekami, ale również leków między sobą. Pozwala na to sieć stworzoną na podstawie podobieństwa profili ekspresji genów pod wpływem substancji aktywnej. W ten sposób powstały grupy leków o wspólnych mechanizmach działania, ułatwiające poszukiwanie ich dodatkowych wskazań.  Na przykład zidentyfikowano podobieństwo pomiędzy Fasudilem (inhibitorem kinazy Rho), a deoksy-D-glukozą. Idąc tym tropem wyciągnięto wniosek, że skoro deoksy-D-glukoza wywołuje autofagię, to Fasudil może indukować podobny efekt. Testy in vitro potwierdziły to przypuszczenie.

Stosowanie metod analizy map połączeń wydaje się ciekawym i stosunkowo prostym sposobem repozycjonowania leków. Każde podejście ma jednak wady. W przypadku CMap jest to między innymi trudna do oceny dokładność i stosunkowo często pojawiające się  zafałszowanie wyników w postaci odnajdowania nieprawdziwych połączeń. Należy bowiem pamiętać, że każda wytypowana zależność musi zostać poddana weryfikacji klinicznej, a to wiąże się z dużymi kosztami. Dąży się również do zwiększenia liczby linii komórkowych, dla których profile ekspresji genów znajdują się w bazie oraz redukcji liczby analizowanych genów. W planach jest badanie ekspresji tylko tych genów, które stanowią charakterystyczne znaczniki, a nie całego genomu.

Wirtualne puzzle

Kolejnym podejściem bazującym na danych pochodzących z badań molekularnych jest dokowanie molekularne. Metoda ta, polega na stworzeniu zestawu algorytmów umożliwiających przewidzenie interakcji między celami molekularnymi, a znanymi już lekami, które mogą na nie potencjalnie oddziaływać. Kluczowe jest tutaj stworzenie stosunkowo dokładnego modelu targetu charakterystycznego dla choroby. To właśnie bazując na nim, metody komputerowe „dopasowują” związek mogący teoretycznie stanowić lek w danej chorobie. Może się to dziać na dwóch drogach – poprzez analizę podobieństwa strukturalnego targetu, na który oddziałuje dany lek, z targetem, w stosunku do którego poszukiwana jest substancja aktywna, bądź na podstawie podobieństwa znanej substancji aktywnej do struktury celu na jaki ma oddziaływać. W literaturze znaleźć można również podejście „odwrotnego” screeninigu polegające na poszukiwaniu dodatkowych targetów dla określonego związku. W tym przypadku bazuje się na strukturze ligandu a nie bezpośrednio celu. Korzystając z metod dokowania molekularnego znaleziono dodatkowe zastosowanie entkaponu – leku stosowanego w terapii choroby Parkinsona, do leczenia wielolekoopornej gruźlicy. Poszukiwania zaczęto od stworzenia modelu miejsc wiązania targetu na podstawie struktur leków obecnych na rynku. W kolejnym kroku wykorzystano metody komputerowe do identyfikacji białek o podobnych elementach struktury, mogących stanowić miejsca wiązania ligandu. Następnie, korzystając z metod dokowania molekualrnego, oceniono kandydatów na substancje, które potencjalnie wchodzą w interakcje z tymi białkami.

Dodatkowo, niedawno wykazano, że przewidywania oparte o strukturę przestrzenną mogą być poddawane dokładniejszej analizie w oparciu o dodatkową wiedzę dotyczącą procesów metabolicznych, czy profili ekspresji genów.

Dość oczywistym ograniczeniem metod dokowania molekularnego jest konieczność znajomości struktury 3D zarówno ligandu, jak i białka docelowego. Obecnie szereg fizjologicznie ważnych białek nie posiada jednak w pełni zdefiniowanej struktury. Dodatkowo, okazało się, że wyniki tego typu analiz dają stosunkowo często wyniki fałszywie dodatnie. Może to wynikać z błędów w strukturach białkowych oraz braku możliwości pełnego modelowania interakcji atomowych i molekularnych między ligandem a celem, na który potencjalnie oddziałuje. Metoda ta stwarza jednak duże szanse rozwoju w dziedzinie repozycjonowania leków.

Co z tego wynika?

Jak widać, prace nad repozycjonowaniem leków rozwijają się bardzo dynamiczne korzystając coraz szerzej z możliwości oferowanych przez komputerowe metody obliczeniowe. Należy jednak pamiętać, że zawsze konieczna jest dokładna analiza danych uzyskiwanych z wykorzystaniem programów komputerowych i baz danych. Dla maszyny jest to bowiem jedynie proces przetwarzania posiadanych informacji na podstawie stworzonego algorytmu. Dla człowieka siedzącego za monitorem są to ogromne możliwości postępu, ale również duże ryzyko popełnienia błędu prowadzące do znacznych strat zarówno, czasu jak i pieniędzy.