Czym jest alternatywny splicing?

Sekwencje kodujące białka (eksony) w genach są oddzielone przez sekwencje niekodujące (introny). W procesie zwanym splicingiem introny są precyzyjnie usuwane, a eksony łączone, co prowadzi do powstania dojrzałej cząsteczki mRNA. Za splicing odpowiada dynamiczna maszyna splicingowa zwana spliceosomem. [1] W procesie alternatywnego splicingu (z ang. alternative splicing, AS) transkrypt RNA jest składany w różnych kombinacjach, co umożliwia powstawanie różnych białek z tego samego genu. Proces ten odgrywa kluczową rolę w różnicowaniu komórek oraz ich adaptacji do zmieniających się warunków, takich jak zmiany temperatury ciała w cyklu dobowym, [2] regulacja zegara biologicznego [3] czy różnicowanie komórek odpornościowych. [4] Ponadto liczne badania wykazały związek AS z rozwojem chorób nowotworowych, neurodegeneracyjnych oraz sercowo-naczyniowych. [5] 

Czym wyróżniają się geny wczesnej odpowiedzi komórkowej?

Geny wczesnej odpowiedzi komórkowej (z ang. immediate early genes, IEG) charakteryzują się szybką i przejściową reakcją na bodźce, tj. stresory, niedotlenienie, promieniowanie UV. Ekspresja IEG jest niezależna od syntezy nowo produkowanych białek, opierając się na ich modyfikacjach, tj. kaskadach fosforylacji. [6] Szybka indukcja ekspresji IEG prowadzi do długoterminowych efektów komórkowych. Geny te odgrywają kluczową rolę w ostrym zapaleniu, aktywności neuronalnej, proliferacji i różnicowaniu komórek, a także regulacji zegara biologicznego. [7] 

Cel pracy doktorskiej

Bezpośrednio po aktywacji limfocyty przechodzą przeprogramowanie metaboliczne, zapewniając stałe dostarczanie energii niezbędnej do pełnienia funkcji efektorowych, np. produkcji cytokin. Mechanizmy te są kluczowe dla pełnej funkcjonalności limfocytów po 24-48 godzinach, jednakże zmiany we wzorcach splicingu genów we wczesnych etapach aktywacji limfocytów nadal pozostają przedmiotem badań. Niniejszy projekt skupiał się na badaniu koncepcji natychmiastowego wczesnego splicingu, wykorzystując analizę bioinformatyczną in silico oraz biochemiczne eksperymenty laboratoryjne.

Wyniki

1. Analiza sekwencjonowania RNA wykryła natychmiastowy wczesny splicing podczas aktywacji limfocytów

Indukcja ekspresji IEG opiera się na kaskadach fosforylacji. [6] Na tej podstawie postawiono hipotezę, że mechanizm splicingu może być podobnie ukierunkowany, jak w przypadku ekspresji IEG. Skupiono się więc na analizie AS w pierwszych minutach aktywacji limfocytów stymulowanych przez octan forbolu mirystynowego (z ang. phorbol myristate acetate, PMA) odzwierciedlający ich fizjologiczną aktywację. Stymulacja była przeprowadzona w odstępach 0, 30 i 150 minut. Sekwencjonowanie RNA wykazało zmiany we wzorcach AS, szczególnie retencję intronów po 30 minutach aktywacji limfocytów. Zmiany AS zaobserwowano m.in w genie eIF5A kodującym białka rybosomalne, wskazując na potencjalny udział natychmiastowego wczesnego splicingu w regulacji translacji, w której główną rolę odkrywają rybosomy.

2. Fosforylowany hnRNPC2 powoduje IES podczas aktywacji limfocytów

W kolejnym kroku dr Dróżdż wyjaśnił, które białko spliceosomu bierze udział w retencji intronów podczas aktywacji limfocytów. Analiza fosfoproteomiczna i eksperyment Western Blot wykazały przejściową zmianę fosforylacji izoformy białka hnRNPC2, czasowo zbieżną z retencją intronów analizowanych genów. Białko hnRNPC wystepuje w dwóch wersjach – C1 i C2 (białko C2 posiada o 13 więcej aminokwasów niż białko C1). [8] Badania te wskazują, że hnRNPC2 jest niezbędny do efektywnego splicingu IEG, który jest regulowany przez ich przejściową fosforylację. Co więcej, wykazano, że hnRNPC2 będący w stanie fosforylacji traci siłę wiązania z intronami, powodując ich retencję. Niniejsze badania dowodzą, że podczas aktywacji limfocytów hnRNPC2 ulega przejściowej fosforylacji, co prowadzi do zmniejszonego wiązania z intronami analizowanych genów, a w konsekwencji – zwiększonej retencji intronów (IR). Wyniki te podkreślają kluczową rolę fosforylacji hnRNPC2 podczas aktywacji komórek T w różnicowaniu funkcji izoform hnRNPC1 i hnRNPC2. Dotychczasowa literatura nie wskazuje na różnice w funkcjonalności między tymi białkami. Badania z Wolnego Uniwersyetu w Berlinie uwypuklają znaczenie fosforylacji w modyfikacjach funkcji między izoformami białka hnRNPC.

3. Natychmiastowy wczesny splicing obniża wynajność translacji białek

Następnym wyzwaniem było określenie funkcji natychmiastowego wczesnego splicingu. Gen eIF5A, u którego zaobserwowano ten mechanizm, koduje białka rybosomalne niezbędne do ich syntezy. [9] Następne badania eksperymentalne wykazały, że zachowany intron prowadzi do powstania nowej izoformy białka EIF5A, którą nazwano eIF5A_IR. Jego nadekspresja znacznie obniżyła syntezę białek. Odkrycia te potwierdzają model, w którym skoordynowana zmiana IES, kontrolowana przez fosforylację hnRNPC2, wpływa na maszynerię translacyjną, zmniejszając tymczasowo translację de novo białek we wczesnych godzinach po aktywacji limfocytów.

Wnioski

W projekcie naukowym dr Mateusz Dróżdż wyjaśnił po raz pierwszy koncepcję natychmiastowego wczesnego splicingu, która występuje na wczesnych etapach aktywacji limfocytów. IES obejmuje retencję intronów, które są bezpośrednio regulowane przez przejściową fosforylację hnRNPC2. Geny zawierające introny, jak w przypadku eIF5A, prowadzą do produkcji nowej izoformy białka EIF5A_IR. Produkt ten powoduje zmniejszenie globalnej translacji po aktywacji limfocytow. Niniejsze wyniki wskazują na ważną rolę alternatywnego splicingu jako potencjalnego celu terapeutycznego w modulowaniu stanu zaplalnego. Dalsze badania w tym obszarze koncentrujące się na interwencjach regulujących proces alternatywnego splicingu mogą przyczynić się do skuteczniejszej kontroli odpowiedzi immunologicznej, szczególnie w kontekście chorób autoimmunologicznych oraz immunoterapii nowotworów. Kluczową strategię terapeutyczną odkrywają terapie oparte na oligonukleotydach antysensownych (ASO) umożliwiające precyzyjną modyfikację splicingu. Takie podejście znalazło już swoje zastosowanie w leczeniu rdzeniowego zaniku mięśni (SMA). [10]