Biotechnologia.pl
łączymy wszystkie strony biobiznesu
Sekwencjonowanie nowej generacji w typowaniu HLA
Sekwencjonowanie nowej generacji w typowaniu HLA
Region HLA (Human Leukocite Antigen) na chromosomie 6 jest najbardziej zmiennym regionem w całym genomie ludzkim. Stąd też stanowi najtrudniejszy obszar DNA do analizy przy pomocy danych uzyskanych z sekwencjonowania NGS (Next Generation Sequencing). Geny HLA pomagają odróżnić własne tkanki od obcych i odgrywają zasadniczą rolę w prawidłowym funkcjonowaniu układu odpornościowego.

Geny HLA stanowią ludzką wersję genów MHC (Major Histocompatibility Complex) kodujących białka, które występują na powierzchni komórek odpowiedzialnych za regulację układu immunologicznego. Kluczowym czynnikiem odpowiadającym za przyjęcie się przeszczepu jest właśnie właściwe dopasowanie alleli HLA. Im przypisuje się związek z wieloma chorobami autoimmunizacyjnymi oraz zakaźnymi. Należy więc uznać HLA za markery biochemiczne, mając na uwadze ich przewagę nad fenotypami obserwowalnymi gołym okiem. Stoją za tym allele wielokrotne  – przykładowo, gen HLA-B ma ponad czterysta alleli, w przeciwieństwie do jedynie dwóch alleli warunkujących zdolność zwijania języka w rurkę. Nasuwa się pytanie – jak to się ma w praktyce ?

Otóż badanie historii rodzin, czyli rodowodów, opiera się na stosowaniu technik genetycznych służących do konstruowania map ukazujących pozycje genów i innych charakterystycznych rodzajów sekwencji w genomie. Dane o dziedziczeniu ludzkich genów uzyskuje się poprzez badanie fenotypów członków rodzin. A więc istotne jest znalezienie takich rodzin, w których rodzice wykazują obecność różnych alleli, a bardziej prawdopodobne będzie to w przypadku badania wspomnianego genu o czterystu allelach, niż tylko dwóch.

Polimorfizmy HLA wykazują ogromną różnorodność, co sprawia, że ich zsekwencjonowanie staje się sporym wyzwaniem. Odpowiedzieć na nie ma technologia sekwencjonowania nowej generacji (NGS). Występuje ono również pod nazwą „wysokoprzepustowe sekwencjonowanie”. Pod tym pojęciem rozumie się oznaczanie rodzaju i kolejności nukleotydów w setkach milionów krótkich sekwencji DNA (między 35 a 100 pz) w jednym pomiarze.

Cechy genów HLA sprawiają, że ich analiza genetyczna to trudne zadanie. Po pierwsze dlatego, że rozległe podobieństwo między paralogami skutkuje zmapowaniem  do wielokrotnych loci. Cecha ta w praktyce dyskwalifikuje do przyrównania sekwencji (ang. alignment). Po drugie, wiele odczytów NGS odrzucanych jest w trakcie mapowania ich do referencyjnego genomu ludzkiego, gdyż wykazują one wiele niedopasowań z sekwencjami znajdującymi się w tym odnośniku (dzieje się tak ze względu na wysoki polimorfizm dopasowywanego regionu). Te dwie ujemne cechy analiz sekwencji w regionie HLA prowadzą do tego, że konwencjonalne techniki takich analiz kończą się odrzuceniem dużej części odczytów. To stanowi przyczynę utraty informacji o polimorfizmach punktowych (SNP) w genach HLA. Jak zauważył dr Endre Major, członek węgierskiej firmy biotechnologicznej Omixon, niezbędne jest wdrożenie procedur nastawionych na skuteczne genotypowanie SNP w HLA. Warunkuje to wyciągnięcie prawidłowych wniosków na temat genotypów uzyskanych na bazie NGS.

Dotychczasowe techniki stosowane do typowania HLA: PCR-SSO i SSP, nadają się w rzeczywistości tylko do celów klinicznych, ponieważ nie odzwierciedlają pełnej informacji cząsteczkowej oraz bywają źródłem wielu dwuznaczności. Fakt ten przemawia na korzyść NGS. Oprócz tego, sekwencjonowanie nowej generacji dostosowane do genów HLA pozwala na określenie odległości cząsteczkowych pomiędzy allelami z uwzględnieniem różnic nukleotydowych. Uwzględnia również zmienność cząsteczkową wynikającą z substytucji synonimicznych w regionach kodujących, a także w niekodujących (intronach i 3’-5’ UTR). Dodatkową praktyczną zaletą NGS jest brak konieczności bycia ekspertem z zakresu obsługi tego narzędzia.

Jednak pomimo tego, że techniki NGS stają się coraz tańsze, mikromacierze pozostają bardziej opłacalnym rozwiązaniem w przypadku dużej ilości prób. Ponadto, NGS nie stosuje się jeszcze rutynowo w typowaniu HLA głównie ze względów metodologicznych, związanych głównie z zawiłościami bioinformatycznymi.

Niemniej jednak, zastosowanie technik NGS umożliwia dobranie dawcy do biorcy o rzadko spotykanym fenotypie. Pozwala też na molekularne zmapowanie regionu MHC, przydatne w badaniach genetyki populacyjnej. Wciąż przybywa danych na temat sekwencji HLA dla różnych populacji na świecie i najprawdopodobniej w kolejnych latach zmieni się spojrzenie naukowców na zmienność tych genów u ludzi. Użycie metod badawczych dostosowanych do uzyskanych danych z pewnością pomoże w rekonstrukcji ewolucji człowieka współczesnego.

Otóż profil genetyczny danej populacji ludzkiej ogólnie opisany jest przez liczbę alleli, do których przypisano określone częstotliwości występowania. Jak wiadomo, organizmy należące do jednego gatunku wykazują olbrzymie podobieństwo na poziomie genetycznym, ważne więc jest użycie w analizie sekwencji o najwyższym stopniu zmienności. Wśród takich sekwencji znajdują się mikrosatelity, mitochondrialny DNA oraz geny o wielu allelach, jak właśnie te z rodziny HLA. Wzorce częstotliwości tych alleli okazały się wyraźnymi sygnałami historii migracji ludzi. Selekcja naturalna odgrywa ważną rolę w kształtowaniu się wzorów różnorodności HLA, a przejawem tego jest znacząca przewaga heterozygotyczności w większości populacji oraz nadmiar niesynonimicznych polimorfizmów wewnątrz loci HLA.

Podsumowując, nauka wkracza w nową erę genomową, charakteryzowaną przez sekwencjonowanie wysokiej przepustowości. W tym świetle, HLA wydaje się być idealnym rodzajem polimorfizmu do badania dla genetyków populacyjnych, zainteresowanych różnorodnością i ewolucją człowieka. Ta wysokoprzepustowa analiza odpowiada na bardzo szeroki zakres pytań, od tych dotyczących historii zaludniania i doboru naturalnego, do tych poruszających tematykę identyfikacji markerów związanych z występowaniem określonych schorzeń. Należy jednak mieć na uwadze konieczność posługiwania się jak największą ilością prób w konstruowaniu baz sekwencji, aby uniknąć zjawiska przypadkowości wyników i wyciągnięcia nieznaczących wniosków.

Źródła

Sanchez – Mazas A., Meyer D. (2014) The Relevance of HLA sequencing in population genetic studies. J Immunol Res, Article ID 971818

Brown T. A. (2013) Genomy. Wydawnictwo Naukowe PWN

http://www.omixon.com/

KOMENTARZE
Newsletter