Biotechnologia.pl
łączymy wszystkie strony biobiznesu
Sc2.0, czyli coraz bliżej sztucznych drożdży
Sc2.0, czyli coraz bliżej sztucznych drożdży
10 marca br. na łamach magazynu „Science” ukazało się siedem publikacji opisujących syntezę kolejnych pięciu chromosomów drożdży Saccharomyces cerevisiae. Jest to kolejny kamień milowy projektu Sc2.0 mającego na celu stworzenie syntetycznych drożdży. Pierwszy z 16 chromosomów S. cerevisiae zsyntetyzowano w 2014 r. Badacze planują otrzymać drożdże z całkowicie syntetycznym genomem do końca roku.


Drożdże piekarskie Saccharomyces cerevisiae to organizm modelowy, którego genom został zsekwencjonowany w 1996 r. Składa się on z 12 156 677 par zasad kodujących 6 275 genów zorganizowanych w 16 chromosomów. Dogłębna wiedza na temat tego jednokomórkowego organizmu eukariotycznego pozwala na jego zastosowanie w produkcji białek, biologii molekularnej, a także jako model procesu starzenia.

Znajomość sekwencji to jednak nie wszystko. Obecna dekada to czas wykorzystania tej wiedzy w biologii syntetycznej, czyli tworzeniu sztucznych genomów. Przełomowym doniesieniem w tej dziedzinie była sztuczna bakteria stworzona w 2010 r. w Instytucie Craig’a Venter’a – Mycoplasma mycoides JCVI-syn1.0 zwana „Synthią”, która powstała poprzez zastąpienie genomu Mycoplasma capricolum całkowicie sztucznym chromosomem M. mycoides o wielkości 1,08 miliona par zasad. W roku 2016, w ramach przedsięwzięcia „Minimal Genome Project”, zespół ten wykorzystał geny JCVI-syn1.0 do stworzenia jeszcze mniejszego genomu JCVI-syn3.0. Składa się on z 531 560 par zasad kodujących 473 geny.

W 2011 r. opublikowano pierwszą pracę opisującą częściowo syntetyczne chromosomy synIXR oraz synVIL S. cerevisiae posiadające odpowiednio sztuczne prawe i lewe ramię. Trzy lata później, w roku 2014 pojawiła się informacja o syntezie pierwszego chromosomu organizmu eukariotycznego S. cerevisiae. Syntetyczny chromosom III (synIII) stworzono w laboratorium prof. Jef’a Boeke na Uniwersytecie Johns Hopkins w Baltimore (USA). Nie był on wierną kopią naturalnego chromosomu III, lecz był pomniejszony o 14% ze względu na usunięcie destabilizujących sekwencji w regionach subtelomerowych, intronów, sekwencji kodujących tRNA oraz transpozonów. Kodony stop w całym chromosomie zostały ujednolicone poprzez zmianę kodonów TAG na TAA. Dodatkowo, każdy gen na chromosomie został „otagowany” sekwencjami umożliwiającymi jego ewentualne usunięcie, zaś geny o mniej istotnych funkcjach oflankowano sekwencjami loxPsym, które umożliwiają rekombinację fragmentów chromosomu w dowolnej orientacji – w procesie tak zwanej indukowanej ewolucji SCRaMbLE (ang. synthetic chromosome rearrangement and modification by loxP-mediated evolution).

Tworzenie syntetycznego chromosomu (przedstawione na schemacie) rozpoczęto od składania 60-79-merowych oligonukleotydów, które składały się na „cegiełki” o długości 750 pz. Sekwencyjne klonowanie owych „cegiełek” do wektora pozwoliło na stworzenie większych „minikawałków” chromosomu o długości 2000-4000 pz. Transformacja drożdży z użyciem zestawu nakładających się „minikawałków” pozwoliła na stopniową, bezpośrednią wymianę naturalnego chromosomu na synIII. Analiza fenotypowa w różnych warunkach środowiska wykazała, że drożdże zawierające synIII nie różnią się istotnie od typu dzikiego pod względem wzrostu, morfologii i dopasowania do panujących warunków, zaś chromosom synIII odznaczał się genetyczną stabilnością. Jest to niewątpliwe osiągnięcie na drodze do otrzymania syntetycznego minimalnego genomu.

Kolejną wyjątkową rzeczą związaną z powstaniem syntetycznego chromosomu jest organizacja procesu syntezy. W tworzeniu synIII uczestniczyli bowiem studenci biorący udział w kursie „Build-A-Genome” na Uniwersytecie Johns Hopkins. Ucząc się technik biologii molekularnej i metod bioinformatycznych, to właśnie studenci zaprojektowali i stworzyli „cegiełki” (750 pz), z których składa się chromosom.

Celem projektu Sc2.0 jest stworzenie minimalnych wersji wszystkich 16 chromosomów S. cerevisiae oraz synteza siedemnastego neochromosomu, który skupiałby wszystkie sekwencje kodujące tRNA, rozmieszczone dotąd na wszystkich chromosomach. W realizację przedsięwzięcia zaangażowane jest międzynarodowe konsorcjum, gdzie poszczególne instytucje z całego świata mają za zadanie zaprojektować i zbudować konkretne chromosomy. Docelowo, syntetyczny genom S. cerevisiae ma być pomniejszony o 8%, a 1,1 mln par zasad ma zostać zmodyfikowana.

 

10 marca 2017 r. na łamach magazynu „Science” ukazało się siedem kolejnych publikacji opisujących pięć kolejnych chromosomów: synII, synV, synVI, synX i synXII – jednego z największych chromosomów S. cerevisiae kodującego rybosomalny DNA. Oznacza to, że badaczom udało się zsyntetyzować już jedną trzecią genomu drożdży. Nie każdy projekt syntetycznego chromosomu przynosi spodziewane rezultaty pod względem przystosowania drożdży i podobieństwa do typu dzikiego, jednak badacze są w stanie ”debugować” otrzymane sekwencje z użyciem technik edycji genomu, takich jak CRISPR-Cas9. W ten sposób nawet drożdże zawierające jednocześnie trzy syntetyczne chromosomy wciąż są zbliżone pod względem morfologii, wzrostu i przystosowania do typu dzikiego. Ponadto, opracowano trójwymiarowy model przewidujący kształt i trajektorie syntetycznych chromosomów w komórkach drożdży, a także przewidziano niektóre zmiany, które mogą nastąpić w procesie SCRaMbLE. Według predykcji, większość wprowadzonych zmian wpływa nieznacznie lub wcale na zachowanie chromosomów w porównaniu do ich naturalnych pierwowzorów. Pewne zaburzenia wiązały się jedynie z usunięciem tzw. wyciszonych kaset koniugacyjnych HML i HMR oraz z usunięciem powtórzeń rDNA w pobliżu centromeru na chromosomie synIII, co powodowało zmiany konformacyjne oraz unieruchomienie jąderka. Identyfikacja tego typu błędów z pewnością pomoże badaczom w ulepszeniu syntetycznych chromosomów.

Badacze i uczestnicy konsorcjum mają nadzieję na finalizację syntezy wszystkich chromosomów S. cerevisiae do końca 2017 r. Wówczas powinniśmy poznać odpowiedź na pytanie, czy komórki drożdży zawierające wyłącznie syntetyczny genom będą w pełni funkcjonalne. Jeżeli to się uda, z pewnością będzie to dzień, który na zawsze wpisze się w historię nauki. Realizowana strategia „bottom-up” polegająca na syntezie chromosomów pozwoli na badanie ramek odczytu o nieznanych dotąd funkcjach, precyzyjne badanie znaczenia pojedynczych genów i analizy ewolucyjne. Dzięki specjalnie zaprojektowanym chromosomom, stworzony w ten sposób organizm będzie można dowolnie modyfikować w celu produkcji określonych substancji, np. leków.

Techniki syntezy i edytowania sztucznych chromosomów wypracowane w projekcie Sc2.0 będą dodatkowo stanowić podwaliny pod realizację kolejnego projektu – Human Genome Project- Write, w który także zaangażowany jest prof. Jef Boeke.

KOMENTARZE
Newsletter