„Lepiej zapobiegać, niż leczyć” – maksyma Hipokratesa urzeczywistnia się w profilaktyce i wczesnej diagnostyce chorób. Poznanie mechanizmów patogenezy schorzeń na poziomie zmian zachodzących w komórkach oraz ich rozprzestrzeniania się leży u podstaw decyzji o właściwym leczeniu. W pracy naukowej często konfrontuje się z faktem, że w liniach komórkowych, które są mocno uproszczonym modelem chorobowym, założenia tezy badawczej nie zawsze znajdują potwierdzenie. Dlatego odwzorowanie rzeczywistych interakcji zachodzących w środowisku tkanki lub narządu jest niezwykle trudne. Analiza mikropęcherzyków zewnątrzkomórkowych zawierających fragmenty membrany komórki dawcy, w których są zawarte wydzielane substancje, może dać odpowiedzi na szereg pytań o ich wpływie na komórki odbiorcy. Dotychczas diagnostyczne znaczenie EVs stwierdzono w chorobach onkologicznych, neurodegeneracyjnych i sercowo-naczyniowych.

Charakterystycznymi elementami EVs jest obecność struktur typowych dla membrany komórkowej: białek błonowych i transbłonowych, takich jak tetraspaniny (TSPAN: CD9, CD63, CD81 itp.) oraz integryn, które wiążą się z białkami macierzy komórkowej. Ponadto w większości mikropęcherzyków stwierdzono obecność CD91 (receptora białek szoku cieplnego), CD317 (białka błonowego hamującego uwalnianie cząstek retrowirusowych) oraz EGFR (z ang. epidermal growth factor receptor – receptora nabłonkowego czynnika wzrostu). Opisane komponenty przyczyniają się do łączenia mikropęcherzyków z docelowymi komórkami, dodatkowo mogą one ulegać S-palmitylacji, która powoduje „znakowanie” i zwiększa specyficzność wiązania.

Wyróżnia się trzy podstawowe grupy mikropęcherzyków zewnątrzkomórkowych: egzosomy (40-150nm), pęcherzyki (150-1000nm), ciałka apoptotyczne (100-1000nm lub 1-5μm). EVs mogą zawierać białka sygnałowe, czynniki transkrypcyjne, enzymy, białka macierzy zewnątrzkomórkowej. Ciekawą grupą są mikropęcherzyki zawierające miRNA, lncRNA (z ang. long non-coding RNA), które ulegają ekspresji po przekazaniu komórkom docelowym. W ten sposób EVs są bogatym źródłem biomarkerów. Ciekawe, że w badaniach nad mikropęcherzykami osocza krwi stwierdzono, że 99,8% tych struktur jest wydzielanych przez komórki hematopoetyczne, a tylko 0,2% EVs jest produkowanych przez inne tkanki.

Warto zaznaczyć, że wydzielanie mikropęcherzyków zachodzi nie tylko w stanach chorobowych, ale też w zdrowych tkankach. Stwierdzono jednak, że komórki nowotworowe produkują ich znacznie więcej ilościowo i jakościowo (w znaczeniu większej dawki zawartości substancji wypełniających mikropęcherzyki). Zaobserwowano, że lipidy budujące otoczkę EVs nieco różnią się składem od typowej błony komórkowej. Membrana mikropęcherzyków jest bogata w sfingolipidy (ceramidy, sfingomielinę, gangliozydy) i wykazuje niską zawartość fosfatydylocholiny oraz diacyloglicerolu. Z tego powodu przypuszcza się, że ceramidy, fosfatydyloseryna, białko PD-L1 (z ang. programmed death ligand 1) są biomarkerami EVs nowotworowych.

Znaczenie diagnostyczne

Opisane cechy charakterystyczne EVs są punktami zaczepienia do ich wykrycia oraz identyfikacji, co składa się na potencjał diagnostyczny i prognostyczny (brane pod uwagę są białka oraz miRNA). Na przykład w badaniach nad rakiem płuca stwierdzono większą ekspresję EGRF na powierzchni mikropęcherzyków zawartych w materiale pobranym od pacjentów w porównaniu do zdrowych osób. Zaobserwowano również, że poziom egzosomalnego miR-378 może być uznany za nieinwazyjny biomarker prognostyczny określający stopień zaawansowania nowotworu płuc. W tej chorobie wysoka ekspresja egzosomalnego miR-146a-5p powiązana jest z odpowiedzią na cisplatynę, podczas gdy miR-425-3p i miR-96 świadczyły o oporności.. Podobnie zidentyfikowano biomarkery diagnostyczne w raku żołądka. Profil o zwiększonym poziomie lncUEGC1, lncUEGC2, LINC00152 oraz lncHOTTIP był charakterystyczny dla wczesnych stadiów choroby i może służyć do wykrycia nawrotu i progresji. Do markerów raka piersi należą: miR-21, miR-155 i miR-222 oraz białka CA 15-3, CA 125 (z ang. cancer antigen) i CEA (z ang. carcinoembryonic antigen). Umożliwiają one wcześniejszą diagnostykę i monitorowanie w trakcie leczenia oraz pojawienia się możliwych przerzutów.

Rola EVs w patogenezie nowotworu – zastosowanie terapeutyczne

Aktualnie najlepiej zbadaną i opisaną grupę stanowią mikropęcherzyki pochodzące z komórek rakowych. Znaczący wpływ EVs odnotowano przy obserwacji powstawania przerzutów. Podtrzymują one mikrośrodowisko nowotworu, przyczyniają się do tworzenia tzw. nisz przedprzerzutowcyh. Poza tym odgrywają ważną rolę w mechanizmach wykształcania oporności na leczenie oraz immunosupresji, a konkretnie:

* promują angiogenezę,

* aktywują różnicowanie komórek immunosupresyjnych – regulatorowych limfocytów T (Treg) oraz supresorowych komórek MDSC (z ang. myeloid-derived suppressor cells),

* pobudzają różnicowanie lub polaryzację różnych typów komórek na pronowotworowe, immunosupresyjne, fenotypy przeciwzapalne i chemiooporne (np. polaryzację monocytów i makrofagów do stanu M2 o właściwościach immunosupresyjnych w mikrośrodowisku nowotworu),

* indukują apoptozę komórek dendrytycznych oraz cytotoksycznych limfocytów T,

* działają hamująco na komórki NK (z ang. natural killers), co skutkuje powstawaniem tzw. zimnych guzów (niezauważonych przez układ odpornościowy, nie powstaje w tych ogniskach stan zapalny), które nie są podatne na immunoterapię.

Jak widać, ten rodzaj EVs ma szczególne znaczenie w medycynie. Opisano dwa podejścia terapeutyczne w badaniach nad rakiem piersi:

* celowanie w obniżenie poziomu wydzielania mikropęcherzyków – np. stwierdzono, że inhibicja białka Rab27b (jednego z kluczowych w procesie powstawania mikropęcherzyków) powodowała zmniejszenie przerzutów,

* wychwytywanie i usuwanie EVs – np. poprzez wprowadzenie przeciwciał specyficznie wiążących charakterystyczne białka na ich powierzchni (CD9, CD63); stwierdzono, że tak oznakowanie EVs zostały wyeliminowane przez makrofagi oraz nie doszło do metastazy.

Mikropęcherzyki są ciekawym modelem bioaktywnych nośników. Cechują się biokompatybilnością oraz zapewniają stabilność enkapsulowanych związków. Efektem niepożądanym jest jednak naturalnie występujący szlak ich usunięcia na drodze fagocytozy makrofagów. Badając skład błony EVs, można zwiększyć specyficzność ich wiązania z komórkami docelowymi, a więc wpływać na farmakokinetykę, zwiększając ich akumulację w mózgu, płucach lub naczyniach. Dodatkową zaletą nanonośników jest ich zdolność do pokonywania bariery krew-mózg. Biorąc pod uwagę te właściwości, w badaniach nad chorobami onkologicznymi stwierdzono pozytywne efekty podania enkapsulowanej doksorubicyny, paklitakselu, kurkuminy, metrotreksatu oraz cispatyny. Komunikacja międzykomórkowa jest skarbnicą wiedzy o stanie zdrowia człowieka i jej poszerzenie może znacząco wpłynąć na współczesną medycynę.