Biotechnologia.pl
łączymy wszystkie strony biobiznesu
Przewodnik po metodach dezintegracji komórek
Przewodnik po metodach dezintegracji komórek
Większość osób zajmujących się pracą laboratoryjną w branży life science stanęła przynajmniej raz przed zadaniem dezintegracji komórek w celu pozyskania materiału biologicznego znajdującego się w ich wnętrzu. Istnieje długa lista metod stosowanych w tym celu, ale która z nich najlepiej się nadaje dla tych konkretnych, na których planujemy przeprowadzić dezintegrację? Poniższy tekst pomoże w odpowiedzeniu sobie na to pytanie.

 

 

Homogenizacja

Tę metodę najczęściej stosuje się przy dezintegracji miękkich tkanek zwierzęcych. Na przykład homogenizator Potter‑Elvenhejma najlepiej sprawdza się dla tkanek serca, wątroby czy mózgu, a homogenizator Dounce'a z kolei dla komórek pochodzących z hodowli tkankowych.

Homogenizacja ma na celu uzyskanie jednorodnej mieszaniny ze składników, które normalnie nie mieszają się ze sobą. Jest to proces mechaniczny. Podczas homogenizacji należy pamiętać o utrzymywaniu obniżonej temperatury (pomiędzy 0-4°C) oraz dodaniu inhibitorów proteaz, RNAz, czy też DNAz (w zależności od rodzaju produktu końcowego, który planujemy otrzymać).

Rozcieranie

Główną zaletą tej metody jest jej prostota. Wykorzystywany sprzęt jest również mało kosztowny ‑ wystarczy moździerz oraz materiał ułatwiający ucieranie (np. piasek kwarcowy czy obojętny tlenek glinu). Rozcieranie stosowane jest do dezintegracji komórek organizmów jednokomórkowych, a najlepiej sprawdza się w przypadku grzybni.

Młyn kulowy

W tym przypadku zawiesina komórek poddawana jest siłom ścierającym wytwarzanym przez kule znajdujące się we wnętrzu młyna poruszającego się ruchem obrotowym. Kule wytwarzane są z materiałów o dużej gęstości, takich jak szkło czy stal. Wydajność tej metody zależy od kilku czynników:

  • Rodzaju mikroorganizmu poddawanego dezintegracji. Młyny kulowe najlepiej sprawdzają się w przypadku grzybów strzępkowych i drożdży, natomiast gorzej dla bakterii. Wynika to z wielkości komórek i budowy ściany komórkowej.
  • Lokalizacji produktu, który staramy się pozyskać. Tą metodą najłatwiej otrzymuje się produkty zlokalizowane w błonie peryplazmatycznej, z kolei trudniej te znajdujące się w cytoplazmie.
  • Rodzaju młyna i czasu trwania procesu. Optymalny rozmiar kul stosowanych przy dezintegracji drożdży i grzybów strzępkowych wynosi 0,25‑0,75 mm, natomiast w przypadku bakterii ‑ 0,1‑0,15 mm. Optymalny stopień wypełnienia komory zawiesiną wynosi około 80%.
  • Stężenia komórek w wykorzystywanej zawiesinie, optymalne to 40‑50%.

Prasa Frencha

Podczas dezintegracji komórek za pomocą tej metody ich zawiesina (odpowiednio wcześniej schłodzona) jest przeciskana przez mały otwór pod wysokim ciśnieniem. Wytworzone w ten sposób siły ścierające niszczą ściany komórkowe. Gdy stosuje się zamrażanie, powstałe kryształy lodu dodatkowo wspomagają dezintegrację.

Budowa typowej prasy Frencha pozwala na wydajną dezintegrację zawiesin komórek o objętościach pomiędzy 10 a 30 ml, jednak staje się trudna w przypadku mniejszych objętości i zbyt czasochłonna dla większych. Tą metodę stosuje się najczęściej mając do czynienia z komórkami bakteryjnymi, drożdżowymi, jak również i roślinnymi.

Sonifikacja

Polega na rozbiciu komórek wibracjami o wysokiej częstotliwości (15‑20 kHz) wywoływanymi przez ultradźwięki. Może być stosowana wyłącznie do dezintegracji komórek znajdujących się w zawiesinie, a najlepsze rezultaty daje w przypadku bakterii i komórek zwierzęcych. Należy pamiętać o utrzymywaniu wibracji na tym samym poziomie, aby zapobiec tworzeniu się piany, która negatywnie wpływa na wydajność procesu. Ograniczeniem tej metody jest fakt, że przy typowej konstrukcji sonifikatora, ilość komórek nie może przekroczyć 1 g w pojedynczym cyklu.

Szok osmotyczny

Ta metoda dobrze sprawdza się w przypadku dezintegracji protoplastów bakterii i drożdży, jak również erytrocytów. Na początku komórki zawieszane są w roztworze hipertonicznym (np. zbuforowanym 20% roztworze sacharozy). Są w nim następnie przetrzymywane w celu utracenia wewnątrzkomórkowej wody. Potem komórki są odwirowywane i zawieszane w wodzie, co powoduje ich pęcznienie i wydzielanie na zewnątrz wewnątrzkomórkowych białek. Poprzez szok osmotyczny można uzyskać od 4 do 7% wewnątrzkomórkowych białek.

Naprzemienne zamrażanie i rozmrażanie

Metoda jest równie prosta, jak sugeruje jej nazwa i dokładnie na tym samym polega. Wzrost objętości wody zawartej w cytoplazmie oraz tworzące się kryształki lodu powodują uszkodzenie ściany i błony komórkowej oraz organelli. Podczas jednego cyklu uwalnia się do 10% wewnątrzkomórkowych białek. Zazwyczaj stosuje się kilka cykli, aby zwiększyć wydajność całego procesu. Ta metoda może być stosowana dla większości rodzajów komórek, jednak posiada istotne ograniczenie. Mianowicie może być wykorzystywana wyłącznie do izolacji białek odpornych na denaturację, ponieważ zamrażanie powoduje częściową utratę wody hydratacyjnej białek.

Trawienie enzymatyczne

Polega na degradacji ściany komórkowej, co prowadzi do powstania protoplastów, które następnie łatwo poddać dalszej dezintegracji, np. poprzez szok osmotyczny. Metoda może być stosowana również jako wstęp przed dalszą dezintegracją mechaniczną i służy do zwiększenia ostatecznej wydajności.

Trawienie enzymatyczne najczęściej wykorzystuje się dla komórek bakteryjnych i drożdży. W przypadku tych pierwszych wykorzystuje się lizozym trawiący peptydoglikany wchodzące w skład ściany komórkowej. W przypadku drożdży używa się zymoliazy, która trawi glukan wchodzący w skład ścian komórkowych tych organizmów. Często wymienianymi wadami stosowania tej metody jest duży koszt przy dużej skali oraz brak powtarzalności.

Liza detergentami

Metoda często stosowana do dezintegracji komórek pochodzących z hodowli tkankowych. Jej główną zaletą jest to, że może być stosowana do uwalniania białek błonowych ‑ ten rodzaj białek jest najtrudniejszy do wyizolowania. Liza detergentami jest bardzo zachowawcza jeśli chodzi o własności izolowanych białek, jeśli jest przeprowadzona poprawnie. Wyróżnia się tzw. permabilizację (podziurawienie błony komórkowej łagodnym detergentem) oraz solubilizację (rozpuszczenie związków organicznych normalnie nierozpuszczalnych w wodzie, np. białek błonowych pochodzących z tratw lipidowych).

Wymienione w tekście sposoby dezintegracji komórek nie są wszystkimi stosowanymi w biotechnologii, są jednak tymi używanymi najczęściej. Innymi dostępnymi metodami są np.: homogenizacja ciśnieniowa, szok termiczny, dekompresja, zastosowanie związków chelatujących, chaotropów, rozpuszczalników, a nawet antybiotyków hamujących syntezę ściany komórkowej.

Źródła

J.E. Bailey, D.F. Ollis Biochemical Engineering Fundamentals, drugie wydanie, Mc Graw‑Hill, 1987
www.embl.de
www.pg.gda.pl
www.rpi.edu

KOMENTARZE
Newsletter