Biotechnologia.pl: Czy mogłaby Pani Profesor pokrótce opowiedzieć o pracach naukowych jakie wykonywane są pod Pani kierunkiem?

Prof. dr hab. Marta Miączyńska: Badania prowadzone w naszej pracowni przebiegają dwutorowo, bo interesują nas dwa procesy zachodzące w komórce. Z jednej strony jest to proces endocytozy –  transportu błonowego polegającego na pobieraniu przez komórki cząsteczek z zewnątrz, np.: substancji odżywczych, czynników wzrostowych, ale i molekuł zapewniających komunikację miedzy komórkami. Z drugiej strony badamy również przekazywanie sygnałów, czyli to w jaki sposób komórka odpowiada na bodźce z zewnątrz i dostosowuje się do nich. W zależności od tego, jaki czynnik na komórkę działa, może ona zmienić swój metabolizm, profil ekspresji genów, ulec podziałom, różnicowaniu się, a czasami nawet śmierci. Przekazywanie sygnałów w komórce jest jednak ściśle powiązane z transportem endocytarnym, ponieważ szereg substancji sygnałowych, z którymi komórka się styka w swoim zewnętrznym środowisku, jest pobieranych do wnętrza właśnie na drodze endocytozy. Proces endocytozy polega na tworzeniu wpukleń w błonie komórkowej, które odrywając się tworzą pęcherzyki. Tysiące tak powstałych pęcherzyków, które określamy mianem endosomów, przemieszcza się we wnętrzu komórki, dostarczając swój ładunek do jej różnych części w sposób niezwykle precyzyjny. Pęcherzyki mogą ulegać fuzji lub rozszczepieniu po to aby dostarczać swój ładunek do odpowiednich, dalszych przedziałów wewnątrzkomórkowych. Przy okazji warto wspomnieć, że za odkrycie podstawowych reguł rządzących transportem pęcherzyków błonowych w komórce przyznano tegoroczną Nagrodę Nobla z  fizjologii i medycyny.

Czyli zależność pomiędzy endocytozą, a przekazywaniem sygnałów w komórce jest dość niezwykła?

Zdecydowanie tak, tym bardziej że przez dekady, te dwa procesy tzn. transportu błonowego i sygnalizacji wewnątrzkomórkowej były badane osobno. W przeciągu ostatnich 10 lat naukowcy doszli jednak do wniosku, że tych zjawisk nie można traktować oddzielnie – przeciwnie, mogą one nawzajem na siebie wpływać. Bardzo często bodźcem, który stymuluje komórkę do konkretnej reakcji, jest na przykład czynnik wzrostowy znajdujący się w środowisku zewnętrznym. Związanie się takiego czynnika do swoistych receptorów na błonie komórkowej uruchamia mechanizmy sygnalizacji wewnątrzkomórkowej – całą kaskadę reakcji chemicznych, która docelowo w jądrze komórkowym indukuje transkrypcję czyli ekspresję genów potrzebnych do podziału komórki. Należy jednak pamiętać, że równocześnie czynnik wzrostowy, który na komórkę zadziałał, wraz ze swoim receptorem ulegnie endocytozie, czyli zostanie przez komórkę pobrany (internalizowany) do pęcherzyków (endosomów). Okazuje się, że ligand związany ze swoim receptorem, już po internalizacji, będąc zlokalizowany w pęcherzyku endosomalnym, w dalszym ciągu może aktywnie stymulować przekazywanie sygnałów. Podręcznikowe twierdzenie, że sygnalizacja wewnątrzkomórkowa pochodzi wyłącznie z błony komórkowej, czyli tylko wtedy kiedy ligand wiąże się do swojego receptora na błonie komórkowej, uruchamiając sygnalizację wewnątrzkomórkową jest nie do końca prawdziwe. Na błonie komórkowej sygnalizacja rzeczywiście się zaczyna, ale później po internalizacji często jest dalej kontynuowana, dopóki ligand z receptorem nie ulegnie ostatecznej degradacji w lizosomach czyli pęcherzykach zdolnych do trawienia swojej zawartości. Czas jaki upływa od związania się ligandu na błonie komórkowej do degradacji w lizosomach, jest to czas ciągłej potencjalnej aktywności liganda w stymulacji przekazywania sygnałów. Okazuje się, że jest wiele białek, które jednocześnie regulują endocytozę i sygnalizację wewnątrzkomórkową. Obecnie interesuje nas w jaki sposób białka o znanej funkcji w procesie endocytozy mogą wpływać na regulację transkrypcji w komórkach.

Skąd u Pani Profesor tak silne zainteresowanie procesami transportu błonowego?

W trakcie mojego stażu podoktorskiego zajmowałam się dwoma białkami o nazwie APPL1 i APPL2. Są one przykładem białek dwufunkcyjnych, które regulują proces endocytozy, ale także uczestniczą w kaskadach przekazywania sygnałów w komórce. Oprócz tego, że białka te zlokalizowane są w cytoplazmie na powierzchni błon endosomów, to mogą być z nich uwalniane i przemieszczać się do jądra komórkowego, gdzie oddziałują z białkami jądrowymi, wpływając na program transkrypcyjny komórki. Po moim przyjeździe do Polski, pierwsze projekty, które podjęliśmy koncentrowały się na dalszym zbadaniu mechanizmów funkcjonowania białek APPL w procesie endocytozy i w procesie przekazywania sygnałów. Odkryliśmy kilka nowych oddziaływań białek APPL z innymi białkami, zarówno w cytoplazmie, jak i jądrze komórkowym. Udało nam się wykazać, że białka APPL uczestniczą w regulacji transkrypcji w szlaku sygnałowym Wnt oraz w szlaku NFκB. Wyniki te złożyły się na zamknięty już cykl kilku prac, w których zajmowaliśmy się przede wszystkim tymi dwoma konkretnymi białkami. Około trzy lata temu zdecydowałam się rozszerzyć spektrum naszych zainteresowań, aby sprawdzić jak dużo jest białek podobnych do APPL1/2, które mają podwójne funkcje: endosomalną i sygnalizacyjną. W tym celu przeprowadziliśmy badania przesiewowe z użyciem techniki RNAi, gdzie wyciszyliśmy ekspresję około 90 genów kodujących białka o znanej funkcji w endocytozie i sprawdzaliśmy w jaki sposób wyciszanie ekspresji tych genów wpływa na transkrypcję w kilku szlakach sygnałowych, m.in. Wnt, NFκB oraz AP1. Obiecujące wyniki, jakie wtedy uzyskaliśmy ujawniły kolejnych ciekawych kandydatów: białka, wcześniej znane jako regulujące endocytozę, które wydają się także wpływać na ekspresję genów. W tej chwili nasze wyniki wskazują, że niektóre z tych białek działają specyficznie w wybranych szlakach sygnałowych, a ich niedobór bądź nadmiar może wpływać na odpowiedź transkrypcyjną komórki, na przykład w szlaku NFκB, który jest głównym szlakiem regulującym odpowiedzi zapalne. Projekty, które aktualnie wykonujemy skupiają się na zrozumieniu mechanizmów molekularnych w jaki sposób białka, które wytypowaliśmy w badaniach screeningowych, regulują konkretne szlaki sygnałowe. Są to badania, które wykonujemy na ustalonych ssaczych liniach komórkowych.

Czy istnieje możliwość, aby państwa badania in vitro znalazły przełożenie na modele zwierzęce?

Przez ostatnie lata bardzo zależało mi na tym, aby poszerzyć spektrum modeli, którymi posługujemy się w naszych badaniach. Wiadomo, że ustalone linie komórkowe są do pewnego stopnia wygodne i łatwe w badaniach, jednak nie zawsze do końca odzwierciedlają rzeczywiste cechy, czy też właściwości procesów, które zachodzą w żywych tkankach. Nasze pierwsze próby zweryfikowania odkryć na poziomie linii komórkowych w innych modelach doświadczalnych odbywały się przede wszystkim na zasadzie współpracy. Natomiast chcę wspomnieć, że przed rokiem w MIBMiK wprowadziliśmy do naszych badań nowy organizm modelowy – rybę Danio pręgowanego (łac. Danio rerio; ang. zebrafish); w ramach projektu finansowanego przez Siódmy Program Ramowy UE o akronimie FishMed. Dlatego obecnie staramy się, aby nasze odkrycia dokonane w liniach komórkowych zostały zweryfikowane na modelu Danio rerio. Szczególnie zależy nam na tym, aby sprawdzić, czy efekty, które zobaczymy na rozwijających się zarodkach Danio rerio po usunięciu badanych przez nas białek będą podobne do tych, które widzimy w ssaczych liniach komórkowych. Jednym słowem chcemy zweryfikować czy badane przez nas powiązania pomiędzy endocytozą a transkrypcją są konserwowane w procesie ewolucyjnym.

A co z knockoutami, czy planują państwo wykonywać eksperymenty na organizmach transgenicznych, które w swoim genomie posiadają wyciszone, konkretne geny?

Na tę chwilę nie stworzyliśmy jeszcze żadnych knockoutów, ale planujemy w tym celu wykorzystać techniki edytowania genomu z użyciem nukleaz typu TALEN or CRISPR/Cas, które specyficznie wiążą się do DNA i mogą ciąć odpowiednie jego fragmenty. Techniki te zaczynają być stosowane do robienia knockoutów Danio rerio. My zaczęliśmy od wyciszenia ekspresji genów z użyciem tzw. morfolino. Jest to rodzaj oligonukleotydów antysensownych komplementarnych do danego mRNA, którego translację chcemy zablokować. Takie antysensowne nukleotydy wstrzykuje się do stadium jednej komórki zarodka i po kolejnych 2-3 dniach, uzyskujemy przejściowy tzw. knockdown, czyli obniżenie produkcji danego białka. Pierwsze wyniki prowadzonych badań są obiecujące. Teraz wiedząc, że wyciszenie ekspresji danego genu powoduje pojawienie się ciekawych fenotypów będziemy mogli myśleć o robieniu knockoutów.

Jakie są źródła finansowania projektów, które obecnie państwo realizują?

Obiecujące wyniki wstępnych badań przesiewowych pozwoliły mi uzyskać finansowanie aktualnie prowadzonych prac z dwóch źródeł. Z jednej strony jest to grant MAESTRO Narodowego Centrum Nauki, w którym badamy nowe funkcje białek endosomalnych w regulacji transkrypcji genów. Równolegle wykonujemy projekt Polsko – Szwajcarskiego Programu Badawczego, gdzie we współpracy z dwoma grupami z Genewy badamy białko TSG101. Wraz z Profesorem Marcos’em Gonzalez-Gaitan’em chcemy sprawdzić, czy mechanizmy, które obserwujemy w przypadku linii komórkowych dla białka TSG101, możemy obserwować również u muszki owocowej lub u Danio pręgowanego. Pragnę podkreślić, że Profesor Gonzalez-Gaitan był nam również ogromnie pomocny przy przeniesieniu do laboratorium MIBMiK całej metodologii molekularnej dotyczącej Danio rerio. Z kolei Profesor Jean Gruenberg ma duże doświadczenie w badaniu procesu endocytozy i zajmował się białkiem TSG101. W przeszłości prowadził on badania transkryptomiczne aby zrozumieć powiązania procesu endocytozy z transkrypcją, co jest niezwykle pomocne w perspektywie założonych przez nas celów badawczych.

A zatem jest nadzieja, ze białko TSG101 może być właśnie jednym z tych białek, które łączy ze sobą transport błonowy i sygnalizację komórkową?

Podwyższoną bądź obniżoną ekspresję genu dla tego białka opisano w wielu typach nowotworów. Mamy nadzieje, że nasze badania przyczynią się do poznawania mechanizmów działania białka TSG101 na poziomie komórkowym. Oprócz udziału w procesach nowotworzenia okazało się, że białko TSG101 uczestniczy w infekcji komórek przez różne wirusy w tym HIV czy Ebola. Ponadto bierze ono również udział w uwalnianiu wirionów z komórki. Dlatego też, naukowców interesuje w jakim stopniu można to białko zablokować, tak aby zatrzymać uwalnianie wirusów z zakażonej komórki. Były próby stworzenia peptydów blokujących miejsca oddziaływania wirusa z białkiem TSG101, ale prace te są ciągle realizowane. Nasze wstępne wyniki wskazują, że wyciszanie ekspresji genu TSG101 może wpływać na odpowiedź transkrypcyjną komórki. Można sobie wyobrazić zatem, że leki które z założenia będą antywirusowe, blokując to białko nie tylko zablokują uwalnianie wirusów, ale także będą wpływać na sygnalizację wewnątrzkomórkową. Mamy nadzieję, że w naszych badaniach odkrywając w jaki sposób TSG101 może wpływać na regulację transkrypcji w komórce, będzie można też zrozumieć z jakimi skutkami ubocznymi będzie można się liczyć w przypadku leków antywirusowych, które mają zablokować funkcje białka TSG101.

Czy prowadzone przez państwa badania podstawowe mają szanse w przyszłości znaleźć zastosowanie aplikacyjne?

Na tym etapie przeprowadzanych eksperymentów, celem jest zrozumienie mechanizmów, które mają miejsce podczas skoordynowania w komórce przekazywania sygnałów i transportu endocytarnego. Oczywiście, jeżeli zrozumiemy te mechanizmy, to będzie można myśleć o ich zastosowaniach. Z jednej strony wydaje się, że można rozważać modulowanie sygnalizacji wewnątrzkomórkowej w kontekście endocytozy pod warunkiem, że będzie to dość specyficzne działanie. Oczywistym jest, że nie możemy zablokować całej endocytozy w komórce, bo to byłoby dla niej śmiertelne. Chodzi głównie o to, aby zrozumieć, czy wpływając na określone białka wewnątrzkomórkowe, można specyficznie zadziałać tylko na konkretny receptor danego czynnika wzrostowego, bądź receptor danej cytokiny. Wydaje się, że komórka ma bardzo wyrafinowane mechanizmy sortowania różnych receptorów do swoich przedziałów endosomalnych i lizosomalnych. Prawdopodobnie istnieją specyficznie sortujące białka adaptorowe, które np.: wiążą się z określonym receptorem, a nie z innym. Można sobie zatem wyobrazić, że zmieniając aktywność tych białek lub blokując ich pewne oddziaływania można by wpływać na czas życia receptora bądź jego aktywację lub inaktywację. Zapewne zrozumienie w jaki sposób następuje wewnątrzkomórkowy transport receptorów cytokin lub czynników wzrostowych do komórki może być w przyszłości jakimś punktem uchwytu terapeutycznego, choć jest to raczej długa perspektywa.

Wszelkiej pomyślności w zdobywaniu nowych funduszy oraz wytrwałości w pracy naukowo-badawczej życzy wszystkim pracownikom Międzynarodowego Instytutu Biologii Molekularnej i Komórkowej portal Biotechnologia.pl

Wywiad przeprowadziła dr Marzena Szwed, redaktor naukowy portalu Biotechnologia.pl