Fot. Stado krów, autor: lek. wet. Aleksander Tabacki

Obecnie tzw. złotym standardem w diagnostyce mastitis są metody oparte na określaniu orientacyjnej liczby komórek somatycznych (np. test TOK), głównie leukocytów, a także zgęstnienia i ześluzowacenia mleka oraz oznaczeniu pH. Bezsprzeczną zaletą tej metody, poza szybkością uzyskania wyników, jest możliwość przeprowadzenia badania bezpośrednio przy zwierzęciu, co jest niezwykle istotne z uwagi na terenowy charakter pracy lekarzy weterynarii [3]. Niestety istotnym jej ograniczeniem jest brak możliwości określenia czynnika etiologicznego wywołującego mastitis.

Wśród najczęściej izolowanych patogenów wymienia się: gronkowce (S. aureus, S.epidermidis), paciorkowce (S. agalactiae,S. dysgalactiae, S. uberis), pałeczki E. coli, ale również glony i grzyby [4]. Z kolei brak znajomości czynnika etiologicznego wymusza na lekarzu wprowadzenie empirycznej terapii antybiotykowej, co może prowadzić do wzrostu odsetka wielolekoopornych szczepów bakteryjnych [5]. Dlatego też, w odpowiedzi na ten problem, naukowcy wspomagani przez przemysł biotechnologiczny prowadzą liczne prace dążące do opracowania innowacyjnych testów, umożliwiających dokładną identyfikację gatunku bakterii.

Metoda klasyczna

Najbardziej klasyczną metodą identyfikacji gatunkowej jest hodowla materiału na odpowiednim podłożu. Warunki hodowli i skład podłoża uzależnione są od badanego patogenu, dlatego też materiał o nieznanej etiologii hodowany jest na różnych typach podłoży, takich jak: podłoża agarowe z dodatkiem krwi, podłoże McConkey’a, podłoże Sabourda, podłoża chromogenne (np. Chrome Agar Mastitis) [6,7]. Zaletami metod hodowlanych są: ich uniwersalność (namnożony materiał można wykorzystać do dalszych analiz), niskie koszty badania oraz brak konieczności posiadania kosztowej, specjalistycznej aparatury. Natomiast wśród ograniczeń należy wymienić m.in.: czasochłonność, niską czułość i specyficzność, niejednokrotnie trudność w jednoznacznej interpretacji, ale przede wszystkim – brak możliwości wykonania analizy w warunkach pozalaboratoryjnych.

Testy molekularne

W ostatnich latach na rynku odnotowuje się ciągły wzrost liczby dostępnych testów molekularnych, opartych na detekcji fragmentów DNA specyficznych dla badanego gatunku bakterii. Wśród najpopularniejszych metod molekularnych należy wymienić przede wszystkim: PCR, czyli łańcuchową reakcję polimerazy, multipleks PCR, czyli odmianę PCR umożliwiającą jednoczesną detekcję kilku genów (np. VetMAX MastiType Multi Kit wykrywający aż 15 gatunków bakterii i grzybów wywołujących mastitis), real-time PCR – łańcuchową reakcję polimerazy w czasie rzeczywistym, w tym także w odmianie umożliwiającej detekcję miRNA (mikroRNA), czyli krótkich sekwencji nukleotydowych w skąpym materiale [8].

Popularność metod molekularnych w diagnostyce wynika z jednoznaczności i powtarzalności uzyskiwanych wyników, a także szybkości procedury badania. Natomiast cechą dyskredytującą uniwersalność tych metod w diagnostyce mastitis jest m.in. konieczność posiadania specjalistycznej aparatury, co przekłada się na koszty analizy, a także niemożność wykonania ich „w terenie”, tj. bezpośrednio przy zwierzęciu.

Metody immunodiagnostyczne i immunochromatograficzne

Alternatywą dla metod molekularnych są metody immunodiagnostyczne, oparte na oddziaływaniach pomiędzy przeciwciałami i antygenami. Wśród nich najpopularniejsze są testy typu ELISA (ang. enzyme-linked immunosorbent assay) oraz metody immunochromatograficzne. 

Test ELISA jest ilościowym lub półilościowym, kilkuetapowym testem, pozwalającym na wykrywanie zarówno przeciwciał, jak i antygenów w badanym materiale. Najczęściej stosowana odmiana ELISA wykorzystywana jest do detekcji przeciwciał różnych klas (IgA, IgM, IgG) w badanej surowicy. Wśród zalet testów immunoenzymatycznych należy wymienić przede wszystkim wysoką czułość i specyficzność, z kolei dywersyfikacja klas przeciwciał pozwala na rozróżnienie infekcji trwającej od przebytej, co jest niezwykle pomocne podczas podejmowania decyzji o wdrożeniu odpowiedniego leczenia. Jednakże wśród ograniczeń należy wymienić relatywną czasochłonność oraz przede wszystkim – tak jak w przypadku wyżej opisanych metod – konieczność przeprowadzenia badania w odpowiednio wyposażonym laboratorium przez doświadczonych techników [9].

Z kolei testy immunochromatograficzne pozwalają na wykrywanie zarówno przeciwciał, jak i antygenów w badanym materiale. Wynikiem, otrzymanym w ciągu kilku minut, jest łatwy w interpretacji układ prążków [10]. Ponadto wykonanie testu nie wymaga wyspecjalizowanej aparatury ani doświadczonego personelu i – co najważniejsze – może zostać przeprowadzony bezpośrednio przy zwierzęciu, a ze względu na niskie koszty pozwala na przebadanie większej liczby zwierząt w stadzie. Obecnie na rynku brak jest testów umożliwiających jednoczesne wykrycie kilku gatunków bakterii wyizolowanych z mleka, stanowiących czynnik etiologiczny mastitis.

W odpowiedzi na ten problem zrodził się pomysł na projekt LIDER pt. „Innowacyjny test diagnostyczny do wykrywania antygenów wybranych gatunków bakterii wywołujących mastitis u bydła”, którego celem jest opracowanie multipleksowego testu immunochromatograficznego do szybkiej identyfikacji czterech najczęstszych patogenów odpowiedzialnych za wywołanie infekcji. Test ten mógłby stać się bardzo przydatny nie tylko dla lekarzy weterynarii, ale także dla hodowców bydła czy właścicieli farm mlecznych. 

Fot. Przykład testu TOK (Terenowy Odczyn Komórkowy) do szybkiej diagnostyki mastitis przed wykonaniem badania (lewa strona) i po wykonaniu badania (prawa strona) – wynik dodatni. Za wynik dodatni testu uznaje się zgęstnienie (zgalarecenie) roztworu i zmianę jego barwy na czerwoną, autor: lek. wet. Aleksander Tabacki.

Badania nad multipleksowym testem immunochromatograficznym do identyfikacji gatunkowej wybranych gatunków bakterii wywołujących mastitis finansowane są przez Narodowe Centrum Badań i Rozwoju w ramach grantu LIDER X nr LIDER/9/0029/L-10/18/NCBR/2019 pt. „Innowacyjny test diagnostyczny do wykrywania antygenów wybranych gatunków bakterii wywołujących mastitis u bydła” o wartości 1 499 277,50 zł.

Autorzy: 

Anna Dobrut, Zakład Molekularnej Mikrobiologii Medycznej, Katedra Mikrobiologii, Uniwersytet Jagielloński Collegium Medicum, Kraków

Aleksander Tabacki, Przychodnia weterynaryjna OMNIWET, Orzesze

Monika Brzychczy-Włoch, Zakład Molekularnej Mikrobiologii Medycznej, Katedra Mikrobiologii, Uniwersytet Jagielloński Collegium Medicum, Kraków