Zjawisko restrykcji i modyfikacji (RM) - mechanizm

Głównym zadaniem systemów restrykcji i modyfikacji jest rozpoznanie obcego DNA oraz jego degradacja na drodze procesu trawienia endonukleolitycznego. DNA chromosomalny komórek, które zawierają ten system, jest w specyficznych sekwencjach odpowiednio zmodyfikowany przez enzym o aktywności metylotransferazy. Obecność tych sekwencji chroni DNA gospodarza przed aktywnością endonukleazy restrykcyjnej. Obce DNA wnikające do komórki, które nie posiada tego wzoru metylacji, podlega degradacji enzymami restrykcyjnym.

Enzymy, które wchodzą w skład systemu to:

• endonukleaza (ang. restriction endonuclease, REaza) - hydrolizuje wiązania fosfodiestrowe w obrębie specyficznych sekwencji niezmetylowanego DNA;
• metylotransferaza - modyfikuje te wiązania poprzez przyłączenie do nich grupy metylowej, co chroni DNA gospodarza przed restrykcją.

Systemy R-M podzielono na cztery grupy - podział uwzględnia właściwości związane z typem rozpoznawanej sekwencji, lokalizację miejsca cięcia w stosunku do rozpoznawanej sekwencji oraz strukturę molekularną systemu.

• typ I - występują u bakterii Enterobacteriaceae, Bacillus subtilis, Neisseria gonorrhoeae, Citrobacter freundii, Mycoplasma pulmonis, Klebsiella pneumoniae, Lactococcus lactis i Staphylococcus aureus. Systemy tej klasy zbudowane są z trzech genów: hsdS, hsdM i hsdR. Są one położone blisko siebie w chromosomie bakteryjnym w tej samej orientacji. Sekwencja przez nie rozpoznawana jest asymetryczna. Składa się ona z dwóch krótkich odcinków zasad o określonej specyficzności, przedzielonych kilkoma niespecyficznymi parami nukleotydów;
• typ II - większość poznanych systemów RM u bakterii Lactococcus należy do tego typu. Są to systemy uznawane za najprostrze i najbardziej rozpowszechnione. Zazwyczaj wymagają prostych kofaktorów i charakteryzują się prostą organizacją genetyczną - w systemach są obecne dwa geny strukturalne, które kodują odpowiednio endonukleazę i metylotransferazę. Endonukleaza rozpoznaje specyficzną, palindromową sekwencję DNA o długości od 4 do 8 nukleotydów i powoduje przecięcie obu nici DNA. Metylotransferaza (wymagająca kofaktora w postaci S-adenozylometioniny) rozpoznaje oraz metyluje tę samą sekwencję, w ten sposób chroniąc DNA przed aktywnością endonukleazy. Cechą charakterystyczną endonukleaz typu II jest fakt, że przecięcie nici DNA ma miejsce w obrębie/w stałej odległości kilku nukleotydów, od miejsca rozpoznawanego przez system RM. Ponadto endonukleazy typu II nie wymagają energii w postaci ATP do przeprowadzenia reakcji, co również je wyróżnia spośród reszty systemów;
• typ III - jest to pierwszy opisany u bakterii gramdodatnich typ systemów RM. Składają się na nie dwa enzymy: metylotransferazy (kodowanej przez gen mod, działającej niezależnie od endonukleazy Res) i endonukleazy restrykcyjnej (kodowanej przez gen res). Ich transkrypcja zachodzi spod wspólnego promotora. Białko Res funkcjonuje w kompleksie z białkiem Mod, dzięki czemu reakcje modyfikacji i restrykcji endonukleolitycznej dotyczą tej samej, specyficznej sekwencji. Endonukleaza Res przecina dwuniciowy DNA w odległości 24-27 nukleotydów poniżej niezmetylowanej specyficznej sekwencji;
• typ IV - najsłabiej poznany typ. Istnieje hipoteza zakładajaca, że ewolucja systemów typu IV rozpoczęła się poprzez fuzje genów podjednostek typu III (Mod i Res). Do tych systemów zaliczono endonukleazy restrykcyjne, które trawią tylko zmetylowane DNA.

Zjawisko restrykcji i modyfikacji (RM) - historia

Zjawisko restrykcji i modyfikacji opisano po raz pierwszy ponad 60 lat temu. To właśnie wtedy naukowcy zaobserwowali, że namnażanie się bakteriofagów bywa w pewnym stopniu hamowane przez niektóre szczepy bakteryjne, które podlegały infekcji. Okazało się, że modyfikacja bakteryjnego DNA w określonym szczepie może chronić przed infekcją fagiem. Jest za to odpowiedzialny szczególny wzór metylacji i swoiste enzymy restrykcyjne (o których więcej przeczytacie w naszym artykule). Wkrótce wykazano, że systemy RM nie ograniczają się jedynie do bakteriofagów, ale dotyczą każdego rodzaju DNA, wnikającego do komórki bakteryjnej w wyniku transdukcji, koniugacji, bądź transformacji. W 1972 roku Paul Berg wraz z zespołem, wykorzystując zasadę działania tych systemów, stworzył pierwsze rekombinowane DNA. Doświadczenie to uznaje się za swoiste narodziny inżynierii genetycznej. Nieco później Herbert Boyer i Stanley Cohen przez hydrolizę enzymami restrykcyjnymi stworzyli pierwszy plazmid in vitro. W 1978 roku odkrycie i opisanie enzymów restrykcyjnych, które  przyczyniło się do rozkwitu technologii rekombinacji DNA oraz nadało nową jakość badaniom z dziedziny genetyki molekularnej, zostało wyróżnione Nagrodą Nobla, którą otrzymali Werner Arber, Hamilton O. Smith oraz Daniel Nathans. Endonukleazy restrykcyjne i towarzyszące im metylotransferazy  stały się jednym z najważniejszych i powszechnie używanych narzędzi badawczych.