Każdego roku miliony ludzi na całym świecie poprzez zanieczyszczoną żywność i wodę zaraża się mikroorganizmami wywołującymi różne choroby. Szacuje się, że rocznie występuje ok. 600 mln chorób przenoszonych przez żywność, co wiąże się z wysokim wskaźnikiem śmiertelności. Centra Kontroli i Zapobiegania Chorobom szacują, że ok. 2,5 mld ludzi w krajach rozwijających się nie ma dostępu do zdrowej i bezpiecznej wody. Z tego powodu każdego roku odnotowuje się ponad 2,2 mln zgonów. Drobnoustroje, takie jak Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Salmonella enterica i Listeria monocytogenes, są zwykle wysoce zakaźne, a obecność zaledwie kilku jednostek tworzących kolonie (CFU) może powodować choroby. Aby uniknąć chorób i ognisk epidemicznych, kluczowe znaczenie ma identyfikacja patogenów na początkowym etapie zakażenia.

Konwencjonalne metody wykrywania bakterii obejmują: hodowlę, barwienie metodą Grama i analizę biochemiczną. Metody te są niezawodne i wniosły ogromny wkład w wykrywanie patogenów, ale mają także swoje ograniczenia – są czasochłonne, analiza próbek często trwa od 2 do 3 dni lub dłużej. Obecne techniki stosowane jako metody kliniczne obejmują: reakcję łańcuchową polimerazy (PCR), test immunoenzymatyczny (ELISA) oraz spektrometrię masową MALDI-TOF (ang. matrix-assisted laser desorption ionization – time of flight). Wyżej wymienione techniki zrewolucjonizowały diagnostykę ze względu na wysoką czułość i swoistość, jednak są nadal kosztowne, proces pobierania próbek musi zachodzić w kontrolowanych warunkach, bywają pracochłonne oraz wymagają wykwalifikowanego personelu. Ze względu na postępy w metodach spektroskopowych do wykrywania patogenów, w tym spektroskopii Ramana wzmocnionej powierzchniowo, rezonansu plazmonów powierzchniowych, spektroskopii fluorescencyjnej, wielokątowego rozpraszania światła laserowego i analizy obrazowania, mogą one stanowić alternatywę dla nowoczesnych metod stosowanych w wykrywaniu patogenów w żywności. W ciągu ostatnich kilku lat pojawiły się pewne trendy w dziedzinie spektrometrii, w tym wykorzystanie nanocząstek, platform mikroprzepływowych, specyficznych elementów biopoznawczych i sztucznej inteligencji. Miniaturowe urządzenia związane ze spektroskopią platform mikroprzepływowych w dziedzinie biosensingu znalazły szerokie zastosowanie w urządzeniach biomedycznych.

Powierzchniowo wzmocniona spektroskopia Ramana (SERS)

SERS to metoda wykrywania w czasie rzeczywistym, która zależy od nieelastycznego rozpraszania światła wzbudzającego i rezonansu molekularnego. SERS dziedziczy chemiczne informacje o odciskach palców w spektroskopii Ramana i zwiększa czułość za pomocą wzbudzenia i rozpraszania wzmocnionego plazmonem. W metodzie SERS nieelastyczne rozpraszanie cząsteczek jest znacznie zwiększone (nawet 108-krotnie), gdy cząsteczki są adsorbowane na pofałdowanych powierzchniach metalowych. Metoda ta może szybko i skutecznie wykrywać szereg struktur chemicznych oraz składów materiałów z wysoką dokładnością i powtarzalnością. Zalety te sprawiają, że SERS jest bardzo obiecującym narzędziem do opracowywania technik wykrywania drobnoustrojów. SERS został zastosowany w różnych aplikacjach do wykrywania i klasyfikacji różnych patogenów, takich jak Yersinia pestis, Francisella tularensis i Bacillus anthracis. Zamiast nanocząstek złota zastosowano specyficzne dla celu nanotagi SERS (nanocząstki złota znakowane reporterem Ramana). Metoda wykryła patogeny w krótkim czasie 15 minut przy użyciu minimalnej objętości próbki 40 µL. Uzyskane granice wykrywalności dla Y. pestis, F. tularensis i B. anthracis wynosiły odpowiednio 43,4 CFU/ml, 45,8 CFU/ml i 357 CFU/ml. Inny biosensor oparty na SERS został wyprodukowany przy użyciu złotych nanoprętów (GNR) skompleksowanych z aptamerami oligonukleotydowymi. Znaczniki SERS zostały połączone z nanocząstkami magnetycznymi modyfikowanymi przeciwciałami w celu jednoczesnego wykrywania Escherichia coli i Salmonella typhimurium. Opracowany biosensor SERS wykazał dobrą liniową odpowiedź od 101 do 106 CFU/ml, wysoką czułość wykrywania (<8 CFU/ml) i współczynnik odzysku 95,26-107,88%.

Sztuczna inteligencja jest szeroko stosowana w różnych aplikacjach diagnostycznych. Uczenie maszynowe i sieci neuronowe to nowe techniki analizy i klasyfikacji danych. Dane spektroskopowe uzyskane z biosensorów SERS i techniki zostały zastosowane w algorytmach uczenia maszynowego i sieci neuronowych. Ding i in. opracowali metodę łączącą SERS z konwolucyjną siecią neuronową (CNN). Podłoże ramanowskie zostało przygotowane przy użyciu nanocząstek złota. Zmierzono różne 1854 widma SERS trzech serotypów Salmonella i zastosowano wieloskalowy model CNN w celu wyodrębnienia cech widmowych SERS. Przygotowane nanocząstki złota i opracowany model CNN wykazały dokładność wykrywania wyższą niż 97%. Podane wyniki dowiodły, że połączenie spektroskopii SERS z CNN jest wykonalne dla serotypowania Salmonella (S. enteritidis, S. typhimurium i S. paratyphi) przy stężeniu bakterii 108 CFU/ml. Algorytm głębokich sieci neuronowych oparty na autoenkoderze został zastosowany przy użyciu SERS do wykrywania opornego na metycylinę Staphylococcus aureus i wrażliwego na metycylinę S. aureus. Opracowany algorytm może oceniać cechy z pozyskanych sygnałów i klasyfikować dane z dokładnością 97,99%. Model głębokiego uczenia klasyfikuje patogeny z obszarem pod krzywą 0,99.

SERS stał się potężnym narzędziem analitycznym do szybkiego wykrywania patogenów. Obecnie nie istnieją jeszcze komercyjnie dostępne techniki wykrywania patogenów za pomocą SERS, ale udoskonalenie tych technik umożliwiło opracowanie podręcznych i przenośnych prototypów do szybkiego wykrywania patogenów.

Rezonans plazmonów powierzchniowych (SPR)

Powierzchniowy rezonans plazmonowy (SPR) to optyczna, bezznacznikowa technologia detekcji do monitorowania w czasie rzeczywistych interakcji wiązań między dwiema lub większą liczbą cząsteczek. Przepustowość, elastyczność i czułość platformy SPR daje naukowcom możliwość charakteryzowania interakcji cząsteczkowych w każdym badaniu dotyczącym wiązań. Badaniu może podlegać szeroki zakres cząsteczek, np. jony, fragmenty, niewielkie cząsteczki, a także białka i wirusy. Technologia SPR umożliwia uzyskanie danych biofizycznych, takich jak powinowactwo, kinetyka i termodynamika. Bioczujniki analityczne na bazie SPR to narzędzia o dużej mocy do charakterystyki interakcji molekularnych. Dla wyników eksperymentu kluczowe znaczenie ma połączenie trzech elementów: detektora, powierzchni czujnika i systemu dostarczania próbek.

Zhou i wsp. zaprojektowali światłowodowy czujnik rezonansu plazmonów powierzchniowych oparty na peptydach przeciwdrobnoustrojowych do identyfikacji E. coli O157:H7 w ciekłym podłożu. Opracowany czujnik miał dobrą specyficzność z granicą wykrywalności 5 × 102 CFU/ml. Powierzchnia plastikowego światłowodu w kształcie litery U została unieruchomiona przeciwciałami bakteryjnymi i pokryta złotem. Wysoce czuły biosensor SPR składa się z pryzmatu, złotej powłoki, grafenu, warstwy powinowactwa i medium detekcyjnego do wykrywania patogenów przenoszonych przez wodę. Czujnik optyczny oparty na cienkiej warstwie cieczy został zaprojektowany poprzez połączenie SPR, wygaszania światła i odbicia pod kątem zbliżonym do krytycznego. Obliczona czułość SPR na współczynnik załamania powierzchni wynosiła 168,35°/RIU. Eksperymenty przeprowadzono w celu oceny krzywej odbicia od próbki zawierającej E. coli w stężeniu 4,7 × 108 CFU/ml.

Ostatnie badania pokazują, że synteza różnych nanomateriałów i zastosowania w SPR wykazują doskonałą skuteczność w wykrywaniu patogenów.

Spektroskopia fluorescencyjna

Istnieją różne techniki spektroskopii fluorescencyjnej do bezpośredniej i pośredniej identyfikacji patogenów przenoszonych przez żywność. Konwencjonalna spektroskopia fluorescencyjna opiera się na organicznych sondach rozpoznawczych znakowanych barwnikami. Ostatnio postępy w rozwoju różnych materiałów, takich jak kropki kwantowe, struktury metaloorganiczne, polimery i kropki węglowe, zostały wykorzystane jako fluorescencyjne znaczniki w testach do wykrywania patogenów. Techniki bezpośredniej fluorescencji opierają się na zastosowaniu naturalnie fluorescencyjnych składników, które zostały użyte do identyfikacji bakterii. Różne reakcje niektórych enzymów z komórkami emitują fotony jako produkt uboczny. Emisja fotonów podczas reakcji tworzy fluorescencję, która jest wykorzystywana w procesie wykrywania różnych patogenów.

Zhao i wsp. opracowali wysoce czuły immunoczujnik do szybkiej identyfikacji E. coli przy użyciu mikrosfer znakowanych kropkami węgla. Spektroskopia fluorescencyjna została zastosowana do analizy emisji długości fali wzbudzenia. Opracowany immunoczujnik ma granicę wykrywalności 2,4 × 102 CFU/ml w mleku i może być testowany w ciągu 30 minut. Wysoce czuły biosensor został opracowany przy użyciu struktury metaloorganicznej na bazie terbu połączonej z przeciwciałami anty-E. coli. Biosensor jest zdolny do wykrywania E. coli w analitach w zakresie od 1,3 × 102 do 1,3 × 108 CFU/ml z granicą wykrywalności 3 CFU/ml. Całkowity czas wykonania eksperymentu wykrywania wynosi ok. 20-25 minut, z czasem odpowiedzi 5 minut.

Inkubacja kropelkowa jest coraz częściej stosowana do opracowywania szybkich metod diagnostycznych. Kaushik i in. przedstawili technikę DropFast wykorzystującą szybką fluorescencję opartą na rezazurynie do hodowli E. coli wewnątrz kropli o objętości pikolitra. Patogeny zamknięte wewnątrz kropli o objętości 20 pL inkubowano przez godzinę, a metoda wykrywania fluorescencji analizowała wrażliwość przeciwdrobnoustrojową. Eksperymenty wykrywania przeprowadzono przy stężeniu próbki 107 CFU/ml. Przeprowadzono również inne badanie potwierdzające słuszność koncepcji w celu wykrycia patogennego DNA przy użyciu amplifikacji izotermicznej z udziałem wielu pętli (LAMP). Mikroprzepływowy chip wykrył trzy patogeny: E. coli, S. aureus oporny na metycylinę i S. aureus wrażliwy na metycylinę. Procedura testowa została przeprowadzona w ciągu 2 godzin, a granica wykrywalności określonych genów wynosiła mniej niż 102 CFU/100 ml. Przetestowano izotermiczną amplifikację opartą na żelu (gLAMP) zintegrowaną z mikroprzepływowym chipem do wykrywania różnych patogenów. Mikrokanały umożliwiają przepływ próbek DNA do komory reakcyjnej w chipie. Do analizy próbki wykorzystano system obrazowania fluorescencyjnego. System wykrył patogeny z wysoką selektywnością i czułością mniejszą niż 1,6 komórki. Mieszanina patogenów została wykryta jednocześnie z 96 kopiami P. hauseri i 36 kopiami Salmonelli. E. coli wykryto przy użyciu 35 kopii.

Biosensory oparte na fluorescencji są bardzo czułe i mają szeroki zakres dynamiczny, który umożliwia szybkie wykrywanie patogenów. Rozwój nanocząsteczek jako sond fluorescencyjnych w celu zwiększenia intensywności fluorescencji w obecności próbek biologicznych wykazał zalety w szybkim wykrywaniu patogenów.

Dynamiczne rozpraszanie światła (DLS)

Lasery są szeroko stosowane do wykrywania mikroorganizmów ze względu na wysoką intensywność i monochromatyczne cechy. Różne teorie rozpraszania światła, w tym teoria Rayleigha, rozpraszanie Mie i teoria Rayleigha-Gansa, zostały zastosowane do przewidywania jednorodnych cząstek. Nowoczesne urządzenia oparte na technikach rozpraszania światła są projektowane w oparciu o modele matematyczne i fizyczne. Dynamiczne rozpraszanie światła (DLS) opiera się na zasadzie ruchu Browna i analizuje czasowe fluktuacje intensywności rozproszonego światła. DLS zostało szeroko zastosowane do oszacowania wielkości cząstek na podstawie rozproszonego światła w środowisku wodnym oraz wykrywania próbek biologicznych. Wykrywanie patogenów zostało przeprowadzone przy użyciu DLS, w którym patogeny są uważane za mikrocząstki. Różne patogeny wykazują unikalne rozpraszanie światła w oparciu o różne rozmiary, kształty i cechy mikrobów.

Hussain i in. zbudowali analizator do wykrywania rozproszonego światła laserowego z mikrobów. Prototyp został zaprojektowany w oparciu o twierdzenie o rozpraszaniu MIE, które dostarcza użytecznych informacji na temat rozpraszania światła przez cząsteczki. Prototyp składa się z zespołu 32 fotosensorów, światła laserowego i systemu akwizycji danych. Zastosowano optymalne stężenie próbki, a światło lasera przechodziło przez przygotowaną próbkę. Otaczające fotodetektory wychwytywały rozproszenie światła, a dane były analizowane przy użyciu analizy statystycznej w celu klasyfikacji patogenów. Drobnoustroje E. faecalis, S. aureus i E. coli zostały przetestowane z 50-70 komórkami w 10 ml wody DI. Średnia dokładność klasyfikacji dla E. faecalis, S. aureus i E. coli wyniosła odpowiednio 81,8%, 70,9% i 71,4%.

Platforma mikroprzepływowa została zaprojektowana do identyfikacji patogenów za pomocą rozpraszania światła przez cząsteczki drobnoustrojów. Urządzenia mikroprzepływowe są pożądane ze względu na miniaturyzację, przenośność i wymaganie mniejszej objętości próbki. Kontrolowany ciągły przepływ drobnoustrojów z kanału mikroprzepływowego pomaga w wykrywaniu rozproszonego światła. Chipy mikroprzepływowe odgrywają istotną rolę w rozwoju urządzeń POCT. Wbudowana platforma mikroprzepływowa została połączona ze światłowodami w celu podłączenia fotosensorów i światła laserowego. Próbka patogenna została oddzielona za pomocą separacji immunomagnetycznej, a oddzielone kulki magnetyczne przepłynęły przez kanał mikroprzepływowy. Światło lasera przechodziło przez kanał mikroprzepływowy, a fotosensory zbierały rozproszone światło z przepływających kulek magnetycznych.

Analiza obrazowania

Przetwarzanie i analiza obrazu są szeroko stosowane do klasyfikacji substancji biologicznych. Przeprowadzono badania nad opracowaniem znaczników fluorescencyjnych do wykorzystania w technikach obrazowania do klasyfikacji drobnoustrojów. Wynaleziony został miniaturowy system wykorzystujący obrazowanie przepływu bocznego do wykrywania Salmonella spp. z limitem wykrywalności 5 × 104 CFU/ml. Urządzenie zapewnia dokładność klasyfikacji na poziomie 95,56% przy użyciu kombinacji przestrzeni kolorów RGB i klasyfikatorów uczenia maszynowego. Qi i wsp. opracowali zautomatyzowany i przenośny system do wykrywania patogenów przy użyciu obróconej separacji magnetycznej Halbacha i obrazowania Raspberry Pi. Przygotowane nanokulki magnetyczne wychwytywały docelowe patogeny, a przechwycone obrazy były analizowane w celu ilościowego określenia stężenia patogenów. Opracowany system był w stanie wykryć Salmonellę z granicą wykrywalności 8 CFU/50 μL w ciągu 60 minut. Inny system oparty na inkubacji kropelek został zaprojektowany do dokładnej diagnostyki opornych na antybiotyki drobnoustrojów jelitowych. Wzrost drobnoustrojów analizowano za pomocą analizy obrazowej, reprezentowanej przez wartość gęstości optycznej fali. Przenośny mikroprzepływowy chip został zaprojektowany do wykrywania Salmonelli w oparciu o jednokomórkowe kropelki. System może wykrywać patogeny z granicą wykrywalności 50 CFU/ml. Kim i wsp. zaproponowali opartą na mikroskopii strukturę do szybkiej identyfikacji patogenów od pojedynczych do kilku komórek. Technika ta uzyskuje i wykorzystuje morfologię badanych próbek poprzez włączenie ilościowego obrazowania fazowego 3D i sztucznej sieci neuronowej. System zidentyfikował 19 gatunków bakterii z dokładnością klasyfikacji 82,5% z określonej komórki bakteryjnej lub klastra.

Sztuczna inteligencja w połączeniu z technikami spektroskopii może przynieść znaczące postępy w dziedzinie technik wykrywania biologicznego, ale istnieje więcej wyzwań związanych z wyborem odpowiedniej techniki do zastosowania w konkretnym problemie. Ponadto duża ilość danych klinicznych jest wymagająca pod względem walidacji wyników i stosowania metod na poziomie komercyjnym.

Postęp w naukach materiałowych i technikach wytwarzania umożliwił produkcję miniaturowych instrumentów optycznych. Synteza zaawansowanych materiałów i wytwarzanie nanocząstek na podłożach SERS poprawiło wykrywanie różnych patogenów przenoszonych przez żywność. Techniki sztucznej inteligencji, w tym uczenie maszynowe i głębokie uczenie, są szeroko stosowane do klasyfikacji danych. W przypadku analizy danych spektroskopowych modele klasyfikacyjne oparte na uczeniu maszynowym skróciły czas wymagany do uzyskania wysokiej dokładności klasyfikacji w porównaniu z analizą statystyczną i modelami matematycznymi. Głębokie uczenie, mikroprzepływy, zaawansowane materiały i robotyka umożliwią automatyzację i wysoką przepustowość w diagnostyce patogenów, a postęp w technologii – stworzenie przenośnych i łatwych w montażu urządzeń. Zautomatyzowane platformy mikroprzepływowe są zdolne do przetwarzania próbek, separacji, generowania kropli i inkubacji. Wszystkie te możliwości można zastosować do opracowania inteligentnych urządzeń wykorzystujących zasadę spektroskopii. Tymczasem w stworzeniu technik spektroskopii, które mają być używane na poziomie komercyjnym, nadal należy stawić czoła wyzwaniom w celu opracowania przyjaznego dla użytkownika, przenośnego i ekonomicznego systemu diagnostycznego. Opracowanie prostych technik i systemów do szybkiej, ekonomicznej i przeprowadzanej na miejscu analizy ma zasadnicze znaczenie dla zdrowia publicznego, diagnostyki medycznej i bezpieczeństwa żywności.