Niedawno zaangażowaliśmy się w temat badań genetycznych, a wszystko to dzięki firmie GNACode z Danii, która to zaprojektowała i wyprodukowała MiniCube PCR, asynchroniczny termocykler. Umożliwia on przeprowadzenie różnych protokołów amplifikacji DNA lub inkubacji równolegle – otrzymujemy więc możliwość przeprowadzenia do 16 eksperymentów równocześnie, w przesuniętym czasie równoległym lub seryjnym.

SciPy dla MiniCube wykonane przez firmę IT Systems

Przejdźmy do naszej roli w całym tym procesie, a mianowicie: oprogramowania Open-Source Scientific Python. Maszyna jest wyposażona w interfejs Open-Source Application, umożliwiający użytkownikom tworzenie własnych programów, które przesyłają protokoły do komputera, aby maszyna wykonała eksperyment, monitorują status oraz wyodrębniają i analizują dane termiczne związane z eksperymentami. Wzięliśmy na siebie zadanie stworzenia środowiska Notebook Jupyter do komunikacji z urządzeniem, a następnie skonfigurowania przykładowego eksperymentu. Następnie został on przypisany do maszyny celem jego wykonania.

To działanie stanie się podstawą dla kolejnych, nowych aplikacji Jupyter Notebook, które tworzą zaawansowane protokoły, jak np. eksperymenty „precyzja gradientu” dla optymalizacji starterów, „kalorymetryczna analiza parowania”, „termiczna analiza reakcji” i wiele innych.

Oprogramowanie ma charakter Open-Source, a my tym samym staliśmy się pierwszymi developerami zewnętrznymi na tej platformie. Umożliwiliśmy naukowcom połączenie się z notebookiem Jupyter na platformie MiniCube, dzięki czemu mogą tworzyć nowe aplikacje do eksperymentów genetycznych i analiz. Tym samym staliśmy się certyfikowanym partnerem firmy GNACode.

Reakcja łańcuchowa polimerazy

Reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR) to technika, w której fragment DNA jest kopiowany przy użyciu termostabilnego enzymu bakteryjnego zwanego polimerazą. Ta technika (patrz uwagi poniżej) za pomocą naprzemiennych cykli chłodzenia i grzania oddziela fragment DNA i multiplikuje go tyle razy, ile materiału jest potrzebne do przeprowadzenia badań (cały proces może być powtarzany x ilość razy, aż do uzyskania żądanej ilości).

DNA, składające się z dwóch podwójnych nici, na początku jest podgrzewane, w wyniku czego energia cieplna powoduje rozdzielenie nici - w naszych komórkach dzieje się to w temperaturze 37°C przy użyciu bardziej złożonych enzymów, ale technika PCR wykorzystuje ciepło po prostu do oddzielenia DNA, gdzie enzym bakteryjny może wytrzymać ten proces, ponieważ jest odizolowany od bakterii, normalnie żyjącej w gorącym środowisku, gdzie życie istnieje w punkcie wrzenia. DNA zostaje rozdzielone, a maszyna schładza probówki.

Mieszanina reakcyjna w probówkach zawiera mniejsze fragmenty DNA zwane starterami, zazwyczaj o długości 20 zasad, które mogą tworzyć wiązanie z oddzielonymi niciami DNA w podwyższonej temperaturze typowo pomiędzy 50-65°. Zawiera między innymi nukleotydy, które są budulcami DNA. Gdy temperatura osiągnie "temperaturę wiązania", zwaną również "temperaturą annealingu" starterów, będą one wiązać się z oddzielonymi łańcuchami DNA, a polimeraza może wykorzystywać ten kompleks "startera" i nici DNA do inicjacji wydłużania lub kopiowania nici DNA przez włączenie nowych nukleotydów od miejsca, w którym kończy się starter. Teraz powstają dwie nowe nici DNA.

Technika PCR wykorzystuje dwa różne startery i można je zaprojektować tak, aby jeden starter wiązał się z jedną nicią DNA, a drugi starter - z przeciwną nicią DNA i tym samym powstaje dwuniciowy fragment DNA, który jest długością odległości między tymi dwoma starterami łącznie. Jeśli mieszanina zostanie ponownie podgrzana, nowo utworzony dwuniciowy DNA zostanie ponownie stopiony tworząc podwójną liczbę pasm równą 2x, gdzie x oznacza liczbę powtórzeń cyklu ogrzewania i chłodzenia. Zazwyczaj reakcje PCR są przeprowadzane w zakresie cykli ogrzewania i chłodzenia między 30-40 razy. Daje to liczbę kopii 240 równą 1099511627776 liczbie nici DNA wykonanych z materiału wyjściowego zaledwie 1 kopii DNA. W rzeczywistości liczba ta nigdy nie jest tak wysoka, ponieważ istnieje ograniczenie liczby kopii, które można zbudować ze względu na liczbę nukleotydów i starterów, które początkowo znajdują się w mieszaninie reakcyjnej.

Asynchroniczna reakcja PCR przeprowadzona przez MiniCube

Maszyna Minicube PCR jest w stanie uruchomić protokół PCR np. tylko na 4 sekcjach z 16, a następnie rozpocząć inkubację w 50°C w dwóch innych sekcjach z odwrotną transkrypcją, gdzie komunikator RNA jest przekształcany w cDNA, a następnie w ustalonym momencie rozpoczyna się druga inkubacja w jednej sekcji w temperaturze 40°C, a współpracownik może wstawić rząd 8 próbówek i tym samym rozpocząć drugą reakcję PCR.

Aby w pełni wyjaśnić funkcję asynchroniczną programu MiniCube PCR można uruchomić 16 różnych protokołów jednocześnie, co oznacza 16 różnych protokołów PCR z różnymi temperaturami startowymi. Jest to możliwe dzięki systemowi pojedynczego dobrego sterowania, połączonego z cechami termicznego zerowego przesłuchu systemu, dzięki czemu idealnie kontrolowane reakcje termiczne mogą współistnieć w odległości zaledwie kilku milimetrów od siebie.

MiniCube PCR idealnie nadaje się do optymalizacji protokołów, przygotowania sekwencjonowania, klonowania czy wielokrotnych równoległych inkubacji. W normalnym trybie, pracując na standardowym sprzęcie, badania te musiały być prowadzone szeregowo, teraz wszystko może być uruchomione równolegle. Możliwe jest odbycie 35 cykli w ciągu 21 minut i 40 sekund ze względu na maksymalną prędkość narastania: 9°C/s. Każda z 16 stacji MiniCube ma skalibrowaną temperaturę wg standardów NIST, a podczas pracy temperatura jest dostosowywana przez mikroprocesor 100 razy na sekundę.

Nowe możliwości w PCR

MiniCube PCR to prawdziwy przełom – nie tylko ze względu na samą elastyczność, ale również dzięki zachowaniu niezwykle wysokiego stopnia dokładności i precyzji urządzenia sprzężonego ze sprzężeniem zwrotnym, które zapewnia doskonale kontrolowane reakcje PCR, których nigdy wcześniej nie udało się osiągnąć inaczej, niż na laboratoriach chipowych. MiniCube może być też wykorzystywany, zdaniem jego twórców, do monitorowania parowania cieczy z próbówek, ponieważ jest to też precyzyjny kalorymeter, który mierzy ilość masy w rurce.

Warto wwspomnieć także o aplikacji MiniCube App, dającej pełną kontrolę nad procesem. Planowanie eksperymentów może odbywać się w biurze, podczas gdy sam eksperyment – w laboratorium. iPad jest w stanie kontrolować kilka urządzeń w tym samym czasie, a użytkownicy mogą również w tym samym czasie mieć równoległy dostęp do urządzeni lub urządzeń.