Brzmi jak scenariusz, który Cię nie dotyczy? Egzotyczna choroba wyeliminowana w Europie w poprzednim stuleciu? Choć dla większości mieszkańców Europy malaria nadal wydaje się odległym problemem, dla milionów ludzi żyjących w krajach Afryki Subsaharyjskiej pozostaje codziennym zagrożeniem i jedną z głównych przyczyn śmierci dzieci poniżej 5. roku życia. Jednocześnie świat, w którym choroba ta była geograficznie odległa, stopniowo się zmienia. Naukowcy od lat poszukują nowych sposobów poprawy diagnostyki, leczenia i profilaktyki, które pozwolą ograniczyć skalę tego zagrożenia w czekającej na nas przyszłości.

Czy malaria może wrócić do Europy?

Malaria pozostaje jednym z największych wyzwań współczesnej medycyny. Według danych Światowej Organizacji Zdrowia w 2024 r. odnotowano ok. 282 mln przypadków malarii i 610 tys. zgonów, z czego większość dotyczyła dzieci w Afryce Subsaharyjskiej [1]. Problem chorób przenoszonych przez komary nie dotyczy już jednak wyłącznie regionów tropikalnych. Choć malaria została w Europie wyeliminowana jako choroba endemiczna, analiza danych epidemiologicznych pokazuje, że w latach 1969–2022 odnotowano kilkadziesiąt przypadków transmisji autochtonicznej, czyli zakażeń, do których doszło bez opuszczania kontynentu [2]. Oznacza to, że przy obecności odpowiednich wektorów i sprzyjających warunkach środowiskowych lokalna transmisja pasożyta pozostaje możliwa. W połączeniu ze zmianami klimatycznymi i rosnącą mobilnością ludzi sprawia to, że zagrożenia związane z chorobami tropikalnymi mogą w przyszłości dotyczyć również Europy Środkowej. W 2023 r. po raz pierwszy odnotowano obecność gatunku Anopheles hyrcanus na terenie Polski, w okolicach Wrocławia – był to jednocześnie najbardziej na północ położony obszar występowania tego potencjalnego nosiciela malarii w Europie [3].

Światło jako narzędzie w badaniach biologicznych

Pomimo postępów w profilaktyce i leczeniu wciąż potrzebne są nowe terapie. Jednym z największych wyzwań pozostaje jednak nie samo odkrywanie potencjalnych leków, ale ocena ich wpływu na komórki i patogeny. Bioluminescencyjne testy reporterowe są szczególnie przydatne w analizie złożonych odpowiedzi biologicznych, ponieważ zapewniają wysoką czułość, szeroki zakres dynamiczny oraz lepszy stosunek sygnału do tła niż metody kolorymetryczne czy fluorescencyjne [4]. W klasycznym eksperymencie komórki transfekuje się konstruktem zawierającym badany fragment DNA, a aktywność reportera odzwierciedla wpływ tego fragmentu na ekspresję genu. Kluczową rolę odgrywa drugi reporter kontrolny, który umożliwia normalizację danych i ograniczenie zmienności wynikającej m.in. z liczby komórek, efektywności transfekcji czy warunków pomiaru [5]. 

W badaniach biologicznych najczęściej stosuje się trzy typy reporterów lucyferazowych. Firefly Luciferase od lat pozostaje klasycznym standardem w analizach dynamicznych zmian zachodzących w komórkach. Renilla Luciferase jest często wykorzystywana jako reporter kontrolny w systemach dual-luciferase. Z kolei NanoLuc®, nowoczesna lucyferaza opracowana przez Promega, wyróżnia się bardzo wysoką intensywnością i stabilnością sygnału, dzięki czemu znajduje zastosowanie w czułych analizach żywych komórek i wysokoprzepustowym badaniu przesiewowym.

Bioluminescencja w odkrywaniu terapii przeciwmalarycznych

W praktyce badawczej systemy z użyciem genów reporterowych są dziś ważnym elementem procesu odkrywania leków. Laboratorium dr. Jacquina Nilesa z Massachusetts Institute of Technology (MIT), badające pasożyta malarii Plasmodium falciparum, wykorzystało system CRISPR/Cas9 oraz reporter Renilla lucyferazy do oceny działania potencjalnych terapii przeciwmalarycznych [6]. Zautomatyzowane badanie przesiewowe w formacie 384-dołkowym pozwalało śledzić wzrost i przeżywalność pasożyta w dużej liczbie próbek, a odczyt sygnału luminescencyjnego przy użyciu luminometrów GloMax® zwiększał szybkość i powtarzalność pomiarów.

Zrozumienie działania leku wymaga jednak obserwowania zmian zachodzących w czasie. Jak pokazują badania zespołu dr. Paula Horrocksa z Liverpool School of Tropical Medicine, pomiar ilości DNA jest zbyt stabilny, aby odzwierciedlać dynamikę odpowiedzi pasożyta na terapię [7]. Dlatego naukowcy stworzyli transgeniczne szczepy P. falciparum syntetyzujące Firefly Luciferase, dzięki czemu mogli monitorować zmiany intensywności sygnału bioluminescencyjnego w czasie rzeczywistym. Spadek intensywności sygnału następował wraz z obumieraniem pasożyta, co pozwalało określać tempo działania i skuteczność badanych terapii.

Systemy oparte na genach reporterowych wspierają również badania nad transmisją malarii (Rys. 1.). Naukowcy z Uniwersytetu w São Paulo stworzyli transgeniczny szczep Plasmodium berghei wykorzystujący NanoLuc® Luciferase do monitorowania rozwoju pasożyta w organizmie komara [8]. Wzrost intensywności sygnału bioluminescencyjnego był bezpośrednio związany z rozwojem pasożyta, co pomagało identyfikować związki blokujące transmisję choroby. Dzięki wysokiej czułości NanoLuc® powstały wydajne systemy wysokoprzepustowego badania przesiewowego kandydatów na nowe leki przeciwmalaryczne.

Rys. 1. Cykl życiowy pasożyta malarii (Plasmodium spp.) obejmujący etapy rozwoju w organizmie człowieka oraz komara z rodzaju Anopheles [8]. Zakażenie rozpoczyna się podczas ukąszenia przez zakażonego komara, po czym pasożyt przechodzi kolejne stadia rozwoju w wątrobie i erytrocytach gospodarza, a następnie ponownie trafia do organizmu komara, gdzie dochodzi do jego dalszego namnażania i transmisji choroby.

Multipleksowanie – więcej danych, mniej niepewności

Mimo ogromnego postępu technologicznego pojedynczy parametr nadal nie daje pełnej odpowiedzi biologicznej. Pomiar wyłącznie aktywności genu reporterowego może prowadzić do mylnych wniosków – spadek intensywności sygnału bywa związany zarówno ze specyficznym działaniem badanego związku, jak i śmiercią komórek. Dlatego coraz częściej stosuje się podejście wieloparametrowe, określane jako multipleksowanie, polegające na jednoczesnej analizie kilku typów odczytów z tej samej próbki [9]. W praktyce może to oznaczać równoczesny pomiar sygnału luminescencyjnego związanego z poziomem ATP i żywotnością komórek, sygnału fluorescencyjnego odzwierciedlającego uszkodzenie błony komórkowej oraz dodatkowych markerów funkcjonalnych związanych z apoptozą, stresem oksydacyjnym czy metabolizmem komórkowym (Rys. 2.). Takie podejście zwiększa wiarygodność wyników i pomaga odróżnić rzeczywisty efekt biologiczny od artefaktów eksperymentalnych. Spadek aktywności biologicznej nie zawsze oznacza bowiem bezpośrednią cytotoksyczność – może wynikać również z zahamowania proliferacji lub zmian metabolicznych zachodzących w komórce. Dodatkową zaletą multipleksowania jest ograniczenie zmienności wynikającej z pracy na wielu niezależnych płytkach hodowlanych.

Rys. 2. Test CellTox™ Green Cytotoxicity Assay.

Panel A. Barwnik CellTox™ Green wiąże DNA komórek z uszkodzoną integralnością błony komórkowej, powodując wzrost sygnału fluorescencyjnego w komórkach martwych lub uszkodzonych.

Panel B. Schematyczne przedstawienie różnych sposobów dodawania barwnika CellTox™ Green do hodowli komórkowej przy pomiarach końcowych oraz w analizach kinetycznych typu no-step. [10].

Rola urządzeń wielomodułowych w analizie wieloparametrowej

Monitorowanie wielu parametrów wymaga odpowiednich urządzeń i czułych metod pomiarowych. Kluczową rolę odgrywają tutaj urządzenia wielomodułowe, takie jak czytniki płytek GloMax®, umożliwiające pomiary luminescencji, fluorescencji, absorbancji oraz analizy BRET i FRET w jednym cyklu pracy (Rys. 3). Zastosowanie różnych metod detekcji upraszcza przebieg eksperymentu i wspiera przejście od prostego pomiaru aktywności do wieloparametrowej analizy odpowiedzi biologicznej komórek i patogenów.

Rys. 3. Czytniki wielomodułowe GloMax® firmy Promega umożliwiające sekwencyjny odczyt sygnałów luminescencyjnych i fluorescencyjnych. Systemy te pozwalają na równoczesną analizę wielu parametrów biologicznych, takich jak żywotność komórek, cytotoksyczność, aktywność reporterów lucyferazowych czy odpowiedź metaboliczna, w ramach jednego eksperymentu.

Szerokie zastosowanie multipleksowania we współczesnym odkrywaniu leków

Dobrym przykładem praktycznego zastosowania multipleksowania jest połączenie testów CellTox™ Green Cytotoxicity Assay oraz CellTiter-Glo® Luminescent Cell Viability Assay opisane przez zespół badawczy Promega Corporation podczas oceny wpływu potencjalnych związków terapeutycznych na przeżywalność komórek HEK293 [10]. Podejście to pozwoliło jednocześnie monitorować uszkodzenie błony komórkowej oraz poziom ATP będący markerem żywotności metabolicznej komórek, bez konieczności przygotowywania równoległych płytek hodowlanych. Badania wykazały, że obecność CellTox™ Green nie wpływała na wyznaczanie wartości IC50 (z ang. half maximal inhibitory concentration), dzięki czemu możliwe było równoczesne uzyskanie informacji o cytotoksyczności i przeżywalności komórek z tej samej próbki, przy ograniczeniu zmienności eksperymentalnej. 

Podobne podejście zastosował zespół Apolloni i współpracowników badający mechanizmy śmierci komórek nowotworowych [11]. Połączenie MultiTox-Fluor™ Multiplex Cytotoxicity Assay z testem Caspase-Glo® 3/7 Assay pozwoliło równocześnie analizować liczbę żywych i martwych komórek oraz aktywację kaspaz, pomagając odróżnić klasyczną cytotoksyczność od procesów apoptotycznych. W badaniach nad SARS-CoV-2 zespół z Niemiec wykorzystał zmodyfikowane wirusy zawierające NanoLuc® Luciferase wraz z testami opartymi na pomiarze ATP, takimi jak CellTiter-Glo®, do równoczesnego monitorowania namnażania wirusa oraz żywotności komórek gospodarza [12]. Takie podejście pomagało odróżnić rzeczywiste działanie przeciwwirusowe od niespecyficznej toksyczności badanych związków podczas wysokoprzepustowych badań przesiewowych kandydatów na leki.

Przyszłość badań biologicznych 

Badania nad chorobami zakaźnymi, takimi jak malaria, wymagają dziś nie tylko nowych terapii, ale również bardziej zaawansowanych metod analizy ich działania. Współczesna biologia komórki coraz wyraźniej pokazuje, że pojedynczy parametr rzadko daje pełny obraz odpowiedzi biologicznej. Dopiero monitorowanie wielu różnych parametrów – aktywności reporterów lucyferazowych, żywotności komórek, cytotoksyczności czy markerów funkcjonalnych – pozwala dokładniej analizować mechanizm działania badanych związków i ograniczać ryzyko błędnej interpretacji wyników.

Rozwój technologii opartych na Firefly Luciferase, Renilla Luciferase oraz NanoLuc® umożliwił przejście od prostych pomiarów końcowych do dynamicznych analiz procesów biologicznych zachodzących w czasie rzeczywistym. W połączeniu z multipleksowaniem oraz urządzeniami wielomodułowymi, takimi jak GloMax®, możliwe stało się jednoczesne monitorowanie wielu aspektów odpowiedzi komórki lub patogenu w jednym eksperymencie – od zmian metabolicznych po mechanizmy śmierci komórkowej i skuteczność terapii. Technologie te są dziś wykorzystywane nie tylko w badaniach nad malarią, ale również w immunoonkologii, badaniach przeciwwirusowych oraz analizach degradacji białek. W świecie, w którym choroby zakaźne, zmiany klimatyczne i globalna mobilność coraz silniej wpływają na zdrowie ludzi, zwierząt i środowiska, wielowymiarowa analiza odpowiedzi biologicznej staje się jednym z kluczowych elementów współczesnej medycyny i odkrywania nowych terapii.

Autorka: Dr Urszula Luzarowska, Scientific Marketing Specialist w Promega GmbH