Technikę dwufotonowej mikroskopii elektronowej opracował w 1990 r. fizyk Winfried Denk, obecnie pracownik Instytutu Neurobiologii Max’a Planck’a. Nagrodę w wysokości 1 miliona euro podzielą także David W. Tank - fizyk z Uniwersytetu Princeton, Karel Svoboda - biofizyk z Janelia Research Campus Instytutu Medycznego Howard’a Hughes’a oraz Arthur Konnerth - neurobiolog z Uniwersytetu Technicznego w Monachium. Uroczyste rozdanie nagród odbędzie się 7 maja w Kopenhadze.

Co dwa fotony to nie jeden

Co wyróżnia mikroskopię dwufotonową spośród innych technik, takich jak mikroskopia konfokalna? Jako metoda fluorescencyjna wykorzystuje ona dobrze poznane fizyczne zjawisko absorpcji, wzbudzenia i emisji. Mechanizm wzbudzenia fluoroforu różni się jednak znacząco od absorpcji pojedynczego fotonu, jak ma to miejsce w mikroskopie konfokalnym. Wzbudzenie dwufotonowe polega na blisko jednoczesnej absorpcji dwóch fotonów o niższej energii wywołującej sumaryczny efekt porównywalny do tego, gdy absorbowany jest pojedynczy foton o większej energii. Laser używany w mikroskopie dwufotonowym emituje niskoenergetyczne fale z zakresu bliskiej podczerwieni, to jest około 700-1000 nm. W przeciwieństwie do długości fal bliskich UV używanych do wzbudzenia klasycznych fluoroforów, promieniowanie podczerwone w znacznie większym stopniu penetruje tanki (nawet do kilkuset mikrometrów), ulega mniejszemu rozproszeniu w badanych próbkach oraz nie prowadzi do szybkiego rozpadu wzbudzanych cząsteczek. Ponieważ prawdopodobieństwo jednoczesnej absorpcji dwóch fotonów jest niezwykle rzadkie, w celu wzbudzenia stosuje się skoncentrowane wiązki fotonów emitowane pulsacyjnie w odstępach femtosekundowych. Dzięki temu, uzyskany efekt wzbudzenia i fluorescencji jest ściśle skoncentrowany w badanym punkcie o objętości około 1 femtolitra. Badana próbka jest skanowana, zaś na całościowy obraz składają się piksele uzyskane w serii pojedynczych pomiarów. Dla celów obrazowania, oprócz klasycznych fluoroforów, które także mają zdolność jednoczesnej absorpcji dwóch fotonów, stosuje się związki specjalnie dedykowane dla tej techniki. Mikroskopia dwufotonowa jest obecnie wykorzystywana w badaniach z dziedziny fizjologii, neurobiologii, embriologii i inżynierii tkankowej, ponieważ pozwala dostrzec subtelne różnice w strukturze tkanek.

Nowa era neurobiologii

Jednym z największych osiągnięć techniki jest możliwość obserwacji zmian zachodzących w mózgu w czasie rzeczywistym in vivo. Z użyciem barwienia przyżyciowego bądź zwierząt transgenicznych zaobserwować można procesy takie jak tworzenie połączeń między neuronami, przewodzenie impulsów nerwowych czy zmiany powstające w wyniku uczenia się lub podejmowania decyzji. Jest to krok milowy w zrozumieniu funkcjonowania ludzkiego mózgu w stanie naturalnym, a także możliwość głębszego poznania procesów neurodegeneracyjnych i demencji. Dostępność tego wyrafinowanego narzędzia obserwacji otwiera także nowe naukowe możliwości, jak obserwacja szlaków przewodzenia czy wyodrębnionych obszarów mózgu pełniących wyspecjalizowane funkcje. W zasięgu ręki jest teraz jednoczesne obrazowanie dużej liczby neuronów oraz możliwość manipulacji procesami biologicznymi w czasie rzeczywistym, na przykład z użyciem technik optogenetycznych, czyli regulacji ekspresji przy pomocy światła. Opracowanie techniki mikroskopii dwufotonowej bez wątpienia zapoczątkowało okres bezprecedensowych odkryć w dziedzinie systemu nerwowego.

1256312_72104957.jpg