Biotechnologia.pl
łączymy wszystkie strony biobiznesu
Mikropęcherzyki pochodzenia komórkowego – nowe perspektywy dla diagnostyki i terapii
Mikropęcherzyki pochodzenia komórkowego – nowe perspektywy  dla diagnostyki i terapii
Gdy w 1967 roku w trakcie badań nad procesami krzepnięcia krwi Peter Wolf po raz pierwszy opisał platlet dust nie spodziewał się, że zaobserwowane przez niego mikrofragmenty pochodzenia płytkowego staną się obiektem zainteresowania naukowców na całym świecie [1]. Rozwój technologii, w tym metod mikro- i spektroskopowych, pozwolił na znaczne poszerzenie wiedzy na temat tych fragmentów komórkowych, zwanych też mikropęcherzykami zewnątrzkomórkowymi (ang. extracellular vecicles - EVs), otwierając nowe perspektywy badawcze i możliwości wykorzystania ich, zarówno jako biomarkerów do diagnostyki chorób jak i terapii z ich zastosowaniem.

 

Mikropęcherzyki zewnątrzkomórkowe

EVs są małymi strukturami (średnica do 4000 nm), [[2]] otoczonymi zazwyczaj dwuwarstwą lipidową, uwalnianymi przez komórki w warunkach fizjologicznych i stanach patologicznych.
 

Ich obecność stwierdzono we wszystkich płynach biologicznych, a ich liczba i skład zmieniają sięw zależności źródła (komórki) i procesów pato- i fizjologicznych jakie towarzyszą ich wytwarzaniu [[3]]. Aktualna klasyfikacja mikropęcherzyków oparta jest o dwa główne kryteria: wielkość i sposób w jaki są one uwalniane z komórek i wyróżnia trzy główne typy pęcherzyków zewnątrzkomórkowych:

  • egzosomy (średnica: 30 – 100 nm) – powstające w ciałkach wielopęcherzykowych wewnątrz komórki,
  • ektosomy (średnica 100 – 1000 nm) – powstające na powierzchni komórki i uwalniane bezpośrednio do przestrzeni zewnątrzkomórkowej,
  • ciałka apoptotyczne (średnica: 1000 nm – 4000 nm) uwalniane z komórek w tracie procesu apoptozy [[4]].

 

Sposób powstawania i co jeszcze?

Przedstawiona klasyfikacja mikropęcherzyków oparta o sposób powstawania nie pokazuje jednak jak zróżnicowane i ciekawe są te struktury. Wykazują istotne różnice pod względem składu lipidowego, białkowego, czy kwasów nukleinowych (DNA i RNA), są one swoistymi nośnikami informacji, pozwalającymi na komunikowanie się komórek na duże odległości. Jedne z badań wykazały, że uszkodzone komórki nabłonka, uwalniają egzosomy dostarczające mRNA dla TGF-β1 i stymulują podziały komórek mięśni gładkich, produkcję kolagenu w fibroblastach, umożliwiając prawidłową regenerację tkanek [[5]]. Inne badania opisują jak ogromną rolę mikropęcherzyki odgrywają w procesach immunologicznych [[6]], regeneracji mięśnia sercowego [[7]] czy utrzymaniu funkcji sytemu nerwowego [[8]].

 

 

EVs – trudna sztuka izolacji

Mając na uwadze możliwości zastosowania mikropęcherzyków zewnątrzkomórkowych w diagnostyce czy terapii konieczne jest opracowanie metod, które umożliwiają ich powtarzalną izolację. Techniki obecnie wykorzystywane do prowadzenia badań nad EVs posiadają wiele ograniczeń, które należy brać pod uwagę przy planowaniu eksperymentów. Jednak myśląc o szerszym niż naukowe zastosowaniu EVs w medycynie, konieczne jest opracowanie metod dobrze zwalidowanych, powtarzalnych i możliwych do zastosowania na dużą skalę.

Najpopularniejsza z obecnie stosowanych technik izolacji EVs to wirowanie różnicowe, w którym zastosowane przyśpieszenia warunkują wielkość EVs otrzymywanych na każdym z etapów [[9]].
 

Im większe przyśpieszenia, tym mniejsze EVs są izolowane (Ryc. 2a). Ta prosta metoda posiada jednak ograniczenia: trudna lub wręcz niemożliwa jest izolacja EVs z dużych objętości np. z mediów komórkowych, czy moczu. Dodatkowo często obserwowana jest koprecypitacja agregatów białek, ciałek apoptotycznych oraz fragmentów komórek wraz z izolowanymi mikropęcherzykami, co skutkuje zanieczyszczeniami EVs i wpływa na jakość izolowanego materiału [[10]]. Często stosowaną modyfikacją tej metody, dającą możliwość dodatkowego rozdzielenia izolowanych EVs na poszczególne frakcje jest wirowanie w gradiencie gęstości  (Ryc. 2b).

Inną popularnie stosowaną metodą izolacji opartą o wielkość cząstek jest chromatografia wykluczania (ang. Size Exclusion Chromatography - SEC). W trakcie przepływu próbki większe cząsteczki (EVs) nie wchodzą w pory znajdujące się w żelowym wypełnieniu kolumny i są wymywane z kolumny jako pierwsze, mniejsze cząsteczki są zatrzymywane w porach i dopiero przy kolejnych etapach wymywania (elucji) opuszczają złoże (Ryc. 2c).

Oprócz metod opierających się na rozdziale EVs ze względu na ich wielkość i gęstość, wykorzystywane są metody opierający się na innych fizycznych lub biologicznych właściwościach mikropęcherzyków np. zdolności egzosomów do precypitacji w obecności roztworów polimerowych (komercyjnie dostępne zestawy oraz ich modyfikacje) [[11]]. Ogromnym ograniczeniem tej metody jest możliwość koprecypitacji agregatów białek, co utrudnia wykrycie markerów charakterystycznych dla egzosomów w innych metodach analitycznych np. cytometrii przepływowej [[12]]. Dodatkowo opracowywane są metody oparte na powinowactwie mikropęcherzyków do określonych rodzajów przeciwciał np. izolacja mikropęcherzyków przy pomocy kulek magnetycznych opłaszczonych przeciwciałami [[13]].

Ograniczeniem tego rodzaju metod, jest ich wybiórczość – tracone są EVs nieposiadające danego antygenu, co może być zarówno zjawiskiem korzystnym, jak i niekorzystnym, jeżeli rozważane jest potencjalne wykorzystanie do diagnostyki chorób. Wiele z opisanych metod jest obecnie na wstępnym etapie badań i wymaga modyfikacji zanim stanie się możliwe ich zastosowanie na większą skalę.

 


Diagnostyka i terapia – futurystyczna wizja, czy rzeczywistość?

Skoro tak trudny jest pierwszy z etapów analizy - izolacja EVs, nasuwa się pytanie, czy możliwe będzie ich wykorzystanie do diagnostyki i w terapii? Odpowiedź jest jednoznaczna: tak, i tego typu badania są już prowadzone, a wiele z nich jest bardzo zaawansowanym etapie.

 

Również w dziedzinie badań nad zastosowaniem terapeutycznym mikropęcherzyków udało się opracować wiele ciekawych protokołów. W 2005 roku został zakończony I etap badań klinicznych nad zastosowanie egzosomów jako nośników leków dla pacjentów z metastatyczną postacią czerniaka [[14]], podobne badania prowadzono nad terapią niedorobnokomórkowego raka płuc [[15]]. Także otwierają się możliwości zastosowania EVs w medycynie regeneracyjnej [[16]].

 

Co dalej?

W najbliższych latach na pewno wiele grup badawczych będzie intensyfikować swoje wysiłki nad wprowadzeniem mikropęcherzyków do rutynowej diagnostyki i terapii. W momencie, w którym posiądziemy umiejętność ich wykorzystania zmieni się sposób postrzegania procesu leczenia. Ciągle jednak podstawowy etap – proces izolacji – stanowi ogromne wyzwanie, a metody obecnie stosowane są trudne do rutynowego zastosowania. Bez ich udoskonalania, bez wprowadzania nowych rozwiązań, postęp w tej dziedzinie będzie trudny.

 

Autorzy:

Anna Drożdż, Agnieszka Kamińska, Ewa Stępień

Zakład Fizyki Medycznej, Wydział Fizyki Astronomii i Informatyki Stosowanej Uniwersytetu Jagiellońskiego

Centrum Transferu Technologii CITTRU, Uniwersytet Jagielloński

 

Literatura:


[1] Wolf P. The nature and significance of platelet products in human plasma. Br J Haematol. 1967;13:269-88.

[2]. C. Lawson, J. M. Vicencio, D. M. Yellon, and S. M. Davidson, “Microvesicles and exosomes: New players in metabolic and cardiovascular disease,” J. Endocrinol., vol. 228, no. 2, pp. R57–R71, 2016.

[3]. E. van der Pol, A. N. Boing, P. Harrison, A. Sturk, and R. Nieuwland, “Classification, Functions, and Clinical Relevance of Extracellular Vesicles,” Pharmacol. Rev., vol. 64, no. 3, pp. 676–705, 2012.

[4]. D. K. Kim, J. Lee, et all., “EVpedia: A community web portal for extracellular vesicles research,” Bioinformatics, vol. 31, no. 6, pp. 933–939, 2015.

[5]. F.T. Borges, S.A. Melo, B.C. Ozdemir, N. Kato, I. Revuelta, C.A. Miller, V.H. Gattone , V.S. LeBleu, R. Kalluri.” TGF-β1-containing exosomes from injured epithelial cells activate fibroblasts to initiate tissue regenerative responses and fibrosis”. J. Am. Soc. Nephrol. JASN. 2013;24:385–392. doi: 10.1681/ASN.2012101031.   

[6]. A. Montecalvo, A.T. Larregina, W.J. Shufesky, D.B. Stolz, M.L. Sullivan, J.M. Karlsson, C.J. Baty, G.A. Gibson, G. Erdos, Z. Wang, Mechanism of transfer of functional microRNAs between mouse dendritic cells via exosomes Blood, 119 (2012), pp. 756–766

3Shiwei Wang, Fabrizia Cesca, Gabriele Loers, 

[7] Gasecka A, van der Pol E, Nieuwland R, Stępień E. Extracellular vesicles in post-infarct ventricular remodelling. Kardiol Pol. 2017 Oct 5. doi:10.5603/KP.a2017.0178.

[8]. S. Wang, F. Cesca, G. Loers, M. Schweizer, F. Buck, F. Benfenati, M. Schachner, R. Kleene. “Synapsin I Is an Oligomannose-Carrying Glycoprotein, Acts As an Oligomannose-Binding Lectin, and Promotes Neurite Outgrowth and Neuronal Survival When Released via Glia-Derived Exosomes’. Journal of Neuroscience 18 May 2011, 31 (20) 7275-7290; DOI: 10.1523/JNEUROSCI.6476-10.2011 

[9]. K. W. Witwer, E. I. Buzás, L. T. Bemis, A. Bora, C. Lässer, J. Lötvall, E. N. Nolte-’t Hoen, M. G. Piper, S. Sivaraman, J. Skog, C. Théry, M. H. Wauben, and F. Hochberg, “Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research,” J. Extracell. Vesicles, vol. 2, no. 1, 2013.

[10]. F. Momen-Heravi, L. Balaj, S. Alian, P. Y. Mantel, A. E. Halleck, A. J. Trachtenberg, C. E. Soria, S. Oquin, C. M. Bonebreak, E. Saracoglu, J. Skog, and W. P. Kuo, “Current methods for the isolation of extracellular vesicles,” Biol. Chem., vol. 394, no. 10, pp. 1253–1262, 2013.

[11]. R. Kanchi Ravi, M. Khosroheidari, and J. K. DiStefano, “A Modified Precipitation Method to Isolate Urinary Exosomes,” J. Vis. Exp., no. 95, pp. 1–5, 2015.

[12]. A. Gámez-Valero, M. Monguió-Tortajada, L. Carreras-Planella, M. Franquesa, K. Beyer, and F. E. Borràs, “Size-Exclusion Chromatography-based isolation minimally alters Extracellular Vesicles’ characteristics compared to precipitating agents,” Sci. Rep., vol. 6, no. 1, p. 33641, 2016.

[13]. F. Momen-Heravi, L. Balaj, S. Alian, P. Y. Mantel, A. E. Halleck, A. J. Trachtenberg, C. E. Soria, S. Oquin, C. M. Bonebreak, E. Saracoglu, J. Skog, and W. P. Kuo, “Current methods for the isolation of extracellular vesicles,” Biol. Chem., vol. 394, no. 10, pp. 1253–1262, 2013.

[14]. B. Escudier, T. Dorval, N. Chaput, F. Andre, M.P. Caby, S. Novault, C. Flament, C. Leboulaire, C. Borg, S. Amigorena, C. Boccaccio, C. Bonnerot, O. Dhellin, M. Movassagh, S. Piperno, C. Robert, V. Serra, N. Valente, J.B. Le Pecq, A. Spatz, O. Lantz, T. Tursz, E. Angevin, L. Zitvogel.  “ Vaccination of metastatic melanoma patients with autologous dendritic cell (DC) derived-exosomes: results of the first phase I clinical trial”. J. Transl. Med., 3 (2005), p. 10 

[15]. M.A. Morse , J. Garst , T. Osada , S. Khan, A. Hobeika, T.M. Clay, N. Valente, R. Shreeniwas, M.A. Sutton, A. Delcayre, D.H. Hsu, J.B. Le Pecq, H.K. Lyerly. “A phase I study of dexosome immunotherapy in patients with advanced non-small cell lung cancer”. J Transl Med. 2005 Feb 21;3(1):9.

[16] Drożdż A, Stępień E.  Circulating microvesicles in regenerative angiogenesis.  Curr Trends Biomedical Eng & Biosci 3(1): CTBEB.MS.ID.555602 (2017)

 

KOMENTARZE
Newsletter