Biotechnologia.pl
łączymy wszystkie strony biobiznesu
Metody sekwencjonowania – powtórka przed sesją
Metody sekwencjonowania – powtórka przed sesją
Sekwencjonowanie jest odczytywaniem kolejności nukleotydów w genomie. Pozwala na poznawanie struktury i funkcji genów, szukanie mutacji oraz zrozumienie molekularnych mechanizmów ewolucji.

Metoda chemiczna Maxama Gilberta

Sekwencjonowanie za pomocą chemicznej degradacji DNA jest najstarszą techniką. Umożliwia odczytanie sekwencji nukleotydowej w odpowiednio przygotowanym materiale genetycznym. Metoda ta pozwala na wykorzystywanie jedno oraz dwuniciowych odcinków DNA, w którym jeden koniec sekwencji jest znakowany. Ilościową degradację łańcucha zapewniają chemiczne modyfikacje zasad. Zmiany prowadzone są w czterech oddzielnych reakcjach dla próbek: G, A+G, T+C oraz C.

Modyfikacje nukleotydów dla określonych zasad:

  • modyfikacja G – disiarczek metylu zapewnia metylację pierścienia guanozyny i spontaniczne otwarcie pierścienia między C8, a N9
  • modyfikacja A + G – kwas mrówkowy odpowiada za protonację atomów azotu pierścieni purynowych i osłabienie wiązań glikozydowych reszt purynowych
  • modyfikacja T + C – hydrazyna powoduje rozszczepienie pierścieni pirymidyn
  • modyfikacja C – hydrazyna w obecności NaCl zapewnia specyficzność wobec reszty cytydyny

Następnie dodaje się enzym – piperydynę, który odpowiada za hydrolizę wiązań N-glikozydowych oraz wiązań fosfodiestrowych po stronie 3’ zmodyfikowanych zasad. Produkty uzyskane w poszczególnych reakcjach poddaje się elektroforezie w żelu poliakrylamidowym, na którym widać tylko znakowane fragmenty.

Metoda świetnie się sprawdza podczas analizy łańcuchów trudnych do przepisania przez polimerazę DNA np. sekwencji palindromowych bogatych w pary GC. Wadą tej techniki jest duża toksyczność wykorzystywanych odczynników.

Metoda dideoksy Sangera i Coulsona

Technika wykorzystuje wariant polimerazy I DNA E.coli w replikacji jednoniciowego DNA. oraz zmodyfikowane deoksynukleotydy. 2’3’-dideoksynukleotydy nie posiadają grupy hydroksylowej w pozycji 3’. Nie mogą one tworzyć wiązania fosfodiestrowego, a ich włączenie skutkuje zakończeniem tworzenia nowej nici.

Specyficzny starter oligonukleotydowy określa punkt startu dla wszystkich nowo syntetyzowanych cząsteczek DNA. Polimeraza tworzy nową nić z naturalnych deoksynukleotydów do momentu przyłączenia odpowiedniego ddNTP (dideoksynukleotydu).

Reakcje przeprowadzane są w czterech probówkach, z których każda zwiera:

- tę samą matrycę

- starter

- mieszaninę deoksynukleotydów (dATP, dTTP, dCTP, dGTP)

- bufor

- polimerazę DNA

- jeden z ddNTP znakowany promieniotwórczo (odpowiednio: ddATP, ddTTP, ddCTP, ddGTP)

Stosowanie odpowiednich stężeń normalnych nukleotydów i dideoksynukleotydów sprawia, że tworzone nici DNA będą zakończone, w każdej możliwej pozycji zasady. Przeprowadzenie reakcji umożliwia uzyskanie zestawu fragmentów o wszystkich możliwych długościach.

Produkty z czterech probówek rozdziela się przez elektroforezę w denaturującym żelu poliakrylamidowym i poddaje się autoradiografii. Otrzymany wzór prążków pozwala bezpośrednio odczytać sekwencję DNA.

Udoskonaleniem metody jest stosowanie dideoksynukleotydów znakowanych fluorescencyjnie, dzięki czemu nie trzeba korzystać z izotopów, które bywają niebezpieczne. Ulepszenie techniki polega na wykorzystaniu czterech różnych barwników fluorescencyjnych dla zmodyfikowanych nukleotydów. Pozwala to na wykonanie jednej niezależnej reakcji, zamiast czterech osobnych. Następnie wykonywany jest rozdział elektroforetyczny, a wynik otrzymywany jest w postaci chromatogramu.

Pirosekwencjonowanie – sekwencjonowanie w czasie rzeczywistym

Jest to metoda sekwencjonowania DNA w czasie rzeczywistym, jest ona jedną z metod nowej genracji. Technika wykorzystuje analizę błysków chemiluminescencji, emitowanych podczas przyłączania kolejnych nukleotydów.

W reakcji  niezbędne są cztery enzymy: fragment Klenowa polimerazy DNA I, sulfurylaza ATP, lucyferaza i apiraza. Proces rozpoczyna się od przygotowania jednoniciowej matrycy, a następnie oczyszczenia jej z nie przyłączonych nukleotydów i starterów. Fragment Klenowa polimerazy DNA I katalizuje przyłączenie komplementarnego trifosforanu nukleozydu (dNTP) do matrycy. W reakcji uwalniany jest pirofosforan. Z powstałego związku i dodanego  adenozyno-5’-fosfosiarczanu powstaje ATP. Przekształcenie katalizowane jest przez sulfurylazę ATP. Otrzymany produkt jest substratem w kolejnej reakcji. Lucyferaza jest utleniana do oksylucyferazy, która emituje strumień fotonów. Światło rejestrowane jest przez kamerę CCD w postaci pików, zwanych pirogramem. Jeśli wprowadzony do mieszaniny reakcyjnej dNTP nie jest komplementarny do matrycy, nie następuje łańcuch reakcji i nie obserwujemy sygnału świetlnego. Apiraza przekształca nie przyłączone trifosforany nukleozydów w monofosforany, dzięki czemu do mieszaniny reakcyjnej można dodać kolejny trifosforan.

Pirosekwencjonowanie wykorzystuje się w wykrywaniu mutacji i polimorfizmów pojedynczych nukleotydów, genotypowaniu wirusów i bakterii, badaniu mitochondrialnego DNA.

Sekwencjonowanie z użyciem chipów

Technologia microchip DNA nie jest jeszcze powszechnie stosowana. Technika ta wykorzystuje 8-oligonukleotydowe sondy, do których hybrydyzuje znakowane fluorescencyjnie DNA. Przyłączenie badanej cząsteczki do danego oligonukleotydu oznacza, że dana sekwencja znajduje się wewnątrz łańcucha DNA. Dokładne dopasowanie sondy do sekwencjonowanej cząsteczki jest analizowane przez specjalny czytnik. Pełną kolejność nukleotydów można wywnioskować po przeanalizowaniu zachodzących na siebie sekwencji.

Źródła

- materiały własne

- Colin Ratledge, Bjorn Kristiansen (red). Podstawy biotechnologii, PWN, Warszawa

2011

KOMENTARZE
Newsletter