Chcąc poradzić sobie z niemożnością zajrzenia do wnętrza preparatu wynaleziono mikrotomy i kriostaty, umożliwiające pocięcie narządu na cienkie plasterki. Niestety taka obróbka narusza trójwymiarową strukturę organu, powoduje zagięcia i zniekształcenia, a dodatkowo jest bardzo pracochłonna. Każdy plasterek trzeba oddzielnie oglądać pod mikroskopem, a w celu uzyskania obrazu 3D nałożyć na siebie wszystkie zdjęcia. Chcąc udoskonalić obserwacje mikroskopowe naukowcy postanowili zająć się samym preparatem i uczynić go transparentnym z jednoczesnym zachowaniem oryginalnej struktury.

Techniki oczyszczania narządów i tkanek skupiają się głównie na równoważeniu współczynnika załamania światła (RI, ang. refractive index) w preparacie. Wyróżniamy metody oparte na rozpuszczalniku, które są udoskonalonym procedurą Spalteholza oraz najnowsze metody bazujące na roztworach wodnych.

Metody oparte na rozpuszczalniku

Składają się zazwyczaj z dwóch etapów. Pierwszym krokiem jest zawsze dehydratacja próbki połączona z rozpuszczaniem lipidów w niej zawartych, drugim jest dodatkowe oczyszczanie oraz dopasowanie współczynnika załamania światła, do współczynnika wykazywanego przez odwodnioną tkankę.

Najbardziej popularną metodą dehydratacji jest ta za zastosowaniem metanolu (czasem z dodatkiem heksanu) lub użycie THF – tetrahydrofuranu. Te substancje powodują usunięcie wody oraz części lipidów z próbki. Odwodnione białka mają wysoki współczynnik RI (>1,5), dlatego następnym krokiem jest inkubacja preparatu w roztworze o zbliżonym RI, który ma jednocześnie zdolność do rozpuszczenia pozostałych lipidów. Przykłady takich metod to: BABB, 3DISCO i iDISCO.

Największym ograniczeniem tych metod jest wygaszanie naturalnej fluorescencji chromoforów występujących w białkach. Do fluorescencji potrzebne są cząsteczki wody, których pozbywamy się w procesie dehydratacji, więc świecenie utrzymywane jest przez kilka dni, a następnie wygasa. Kolejną wadą jest stosowanie toksycznych rozpuszczalników, które mają zdolność do rozpuszczania klejów stosowanych w obiektywach mikroskopu oraz znaczne zmniejszanie objętości próbki podczas odwadniania.

Metody oparte na wodzie

Chęć zachowania autofluorescencji białek i zapobiegania zmianom w architekturze tkanek doprowadziła do wytworzenia nowych metod oczyszczania. Metody te również opierają się na zrównaniu współczynnika załamania światła próbki oraz roztworu, w którym jest zanurzona, a wśród nich możemy wyróżnić trzy podejścia.

Pierwszym z nich jest pasywna imersja polegająca na zanurzeniu tkanki w roztworze wodnym z rozpuszczoną substancją o wysokim RI. Najczęściej stosowanymi substancjami są: glicerol, sacharoza, formamid oraz fruktoza. Praca z wysoko skoncentrowanymi roztworami cukrów czy glicerolu jest utrudniona, ze względu na ich lepkość, powstawanie pęcherzyków powietrza oraz precypitacje cukru w temperaturze pokojowej. Przeszkoda ta została rozwiązana poprzez wytworzenie roztworów o wysokim RI i zmniejszonej lepkości. Metody te nie usuwają lipidów, starają się dopasować RI tkanki do roztworu, w którym jest zanurzona. Nadają się głównie do małych próbek, gdyż im większy preparat tym dotarcie roztworu do środka jest trudniejsze.

Kolejną metodą jest hiperhydratacja stosowana w oczyszczaniu Sca/e, ClearT i CUBIC. Podejście skupia się na usuwaniu lipidów przy użyciu mocznika i zmniejszeniu RI podczas procesu oczyszczania. Molekularny mechanizm obniżania współczynnika RI nie jest do końca poznany, jednak są to rzadziej stosowane metody ze względu na bardzo długi czas przygotowania próbki, dochodzący nawet do kilku miesięcy.

Najnowszym i najbardziej obiecującym podejściem są metody CLARITY i PACT/PARS, skupiające się na osadzeniu tkanki na hydrożelu, a następnie wypłukaniu lipidów.

CLARITY jest metodą, która pozwala na szybkie przekształcenie nienaruszonego narządu w optycznie transparentny i umożliwiający przenikanie makromolekuł narząd o zachowanej natywnej strukturze. Można to osiągnąć poprzez pozbawienie tkanki dwuwarstwy lipidowej tworzącej błony komórkowe. W celu utworzenia swoistej podpory dla komórek i organelli pozbawionych błon lipidowych, tkanka jest zanurzana w monomerach hydrożelu (tworzonych z akrylamidu i bisakrylamidu), w obecności formaldehydu, który wiąże monomery ze składnikami komórki tworząc wewnątrz narządu pewnego rodzaju stelaż. Polimeryzacja następuje poprzez umieszczenie tkanki w 37 stopniach Celsjusza. Aby nie wygaszać fluorescencji przez odwadnianie i rozpuszczalniki, w celu oczyszczenia z lipidów stosuje się elektroforetyczne oczyszczanie tkanek lub pasywne wypłukiwanie lipidów poprzez umieszczenie narządu w specjalnej komorze wypełnionej roztworem płuczącym na mieszadle magnetycznym.

Oczyszczanie tkanek umożliwiło obserwowanie narządów bez naruszania ich struktury. Przyniosło to ogromne korzyści w wielu dziedzinach np. w neurobiologii, gdzie obrazowanie sieci neuronalnych w całym preparacie jest niezbędne do wyciągnięcia odpowiednich wniosków po przeprowadzonym doświadczeniu. Czas oczyszczania waha się od 3 dni do nawet kilku miesięcy w zależności od wybranej metody. Tak samo czas przechowywania próbki po oczyszczeniu, który w metodzie CLARITY wynosi wiele miesięcy, natomiast w metodzie 3DISCO tylko jeden dzień, więc przygotowany preparat należy niezwłocznie analizować pod mikroskopem. Wybór metody zależy od ilości czasu, rodzaju preparatu oraz przeprowadzanego doświadczenia.

Anna Sokołow, stażystka portalu Biotechnologia.pl