Rozwój idei
Kamieniem milowym w rozwoju metabolomiki była realizacja przedsięwzięcia The Human Metabolome Project, które rozpoczęto w styczniu 2005 roku dzięki finansowaniu przez Genome Canada. Projekt miał na celu poznanie i skatalogowanie możliwie pełnego metabolomu ludzkiego. Do 2007 roku udało się opracować i opublikować zarys zestawu metabolitów występujących w tkankach i płynach ludzkich, czego wymiernym wynikiem stała się ogólnie dostępna baza The Human Metabolome Database (HMDB). Zawiera ona informacje na temat wszystkich zidentyfikowanych metabolitów obecnych w organizmie ludzkim. Realizacja projektu przyniosła także niewymierne korzyści w postaci pobudzenia trendu rozwojowego metabolomiki w odniesieniu do toksykologii, biomedycyny i drugdiscovery.
Dziś nikt nie poddaje już w wątpliwość możliwości aplikacyjnych metabolomiki. Wyniki analiz są szeroko wykorzystywane przez badaczy na całym świecie, dając szansę na badanie dynamiki zmian biologicznych zachodzących w wyniku oddziaływania czynników środowiskowych, chorobowych, a także substancji aktywnych czy zmian genetycznych. Dzięki temu możliwe staje się również poszukiwanie biomarkerów, których rola w nowoczesnej biomedycynie jest nieoceniona, czy wreszcie profilowanie metaboliczne.
Techniki analityczne w metabolomice
Metabolomika bywa definiowana jako narzędzie do możliwie całościowej identyfikacji i analizy metabolitów obecnych w danym układzie biologicznym. By ten cel efektywnie realizować, niezbędne jest zastosowanie szeregu wysoko zaawansowanych technik analitycznych i statystycznych. Wśród wykorzystywanych w metabolomice metod analitycznych wymienić należy technikę magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR, ang. nuclear magnetic resonance), spektroskopii w podczerwieni z transformacją Fouriera (FTIR, ang. Fourier transform infrared spectroscopy) oraz spektrometrię mas (MS, ang. mass spectrometry) stosowaną w połączeniu z technikami chromatograficznymi. Każde z dostępnych rozwiązań posiada niewątpliwe zalety, jednak tylko przy właściwym doborze pod kątem celu badania.
Techniki NMR i FTIR są niezastąpionym i niezwykle wydajnym narzędziem w analizach typu fingerprinting. Uzyskiwane widma są niezwykle złożone i choć nie pozwalają na identyfikację pojedynczych metabolitów, to dają możliwość uzyskiwania specyficznych wzorów spektralnych dla określonych prób oraz do badania dynamik ich zmian pod wpływem różnych czynników, na przykład chemicznych. NMR i FTIR wymagają jedynie minimalnego przygotowania prób do badań. Jednakże oznaczanie jakościowe i ilościowe metabolitów realizowane jest z wykorzystaniem spektrometrii mas w jej połączeniu z chromatografią cieczową (LC, ang.liquid chromatography) lub gazową (GC, ang.gas chromatography). Techniki te, określane skrótowo jako LC‑MS i GC‑MS, charakteryzuje wysoka czułość. Chociaż w tym wypadku przygotowanie próbki do badania jest niezmiernie istotnym i złożonym problemem, to dzięki tym metodom możliwe stają się kompleksowe badania metabolomu. Od pewnego czasu GC‑MS i LC‑MS dominują w metabolomice, o czym świadczą statystyki publikacji naukowych z tego obszaru.
GC‑MS
Technika GC‑MS uważana jest obecnie za najbardziej optymalne narzędzie do kompleksowych badań metabolomicznych. Jest to podyktowane ideą połączenia efektywnej techniki separacyjnej, jaką jest chromatografia gazowa, z czułą detekcją masową. W uproszczeniu metoda opiera się na zasadzie, że obecne w próbce metabolity w pierwszej kolejności ulegają rozdzieleniu, a to skutkuje znakomitą redukcją złożoności powstającego następnie widma masowego. Rozwój technologii pozwala obecnie na jednoznaczną identyfikację większości metabolitów w czasie jednej analizy. Wysoka rozdzielczość uzyskiwanych widm umożliwia zarówno oznaczenie określonych metabolitów, jak również identyfikację tych nieznanych.
Agnieszka Ulanowska, LECO Polska: W laboratoriach analitycznych coraz częściej spotykane są wysokorozdzielcze spektrometry mas pozwalające rejestrować widma masowe w wysokiej rozdzielczości i dokonywać pomiaru masy jonów z dokładnością do dziesięciotysięcznych części Da (błąd pomiaru masy poniżej 1 ppm). Tak dokładny pomiar masy metabolitów umożliwia niemalże jednoznaczną ich identyfikację w oparciu o bibliotekę widm masowych.
Technika GC‑MS pomimo licznych zalet posiada jednak ograniczenie związane ze spełnieniem kryterium lotności analitów podczas ich analizy. Warunek ten wymusza stosowanie odpowiedniej metody przygotowania próbki. W takim wypadku stosuje się derywatyzację, czyli chemiczną modyfikację próbki w celu zwiększenia lotności analitów. W zależności od rodzaju chemicznego czynnika modyfikującego, stosuje się metody alkilacji, acylacji lub sililacji. Pochodne sililowe wykazują większą stabilność termiczną i lotność niż inne pochodne, a także pozwalają uzyskać czytelniejsze widma masowe, dlatego sililacja jest najczęściej wybieraną metodą.
Jednymi z popularniej stosowanych w badaniach metabolomicznych rozwiązań są systemy Pegasus TOF‑MS (LECO), stanowiące sprzężenie spektrometrii mas czasu przelotu z chromatografią gazową.
W spektrometrach mas wyposażonych w analizatory typu TOF‑MS wykorzystuje się proporcjonalną zależność czasu przelotu jonu (TOF, ang. time of flight) od jego masy. Analizatory TOF, w przeciwieństwie do innych analizatorów, takich jak kwadrupol czy pułapka jonowa, należą do analizatorów nieskanujących, tj. w danej chwili rejestrowane są sygnały pochodzące od wszystkich jonów docierających do detektora. Brak skanowania powoduje, że spektrometry TOF-MS są bardzo szybkie i rejestrują nawet 500 widm masowych w ciągu sekundy.
Ponadto, wszystkie widma rejestrowane w piku chromatograficznym są identyczne i doskonałej jakości, co z kolei pozwala na poprawne przeprowadzanie dekonwolucji oraz automatycznego wyszukiwania pików. Systemy TOF‑MS zawsze pracują w trybie FS (ang. fullscan). Nie ma potrzeby stosowania trybu SIM (ang. selected ion monitoring), aby obniżyć granice wykrywalności, ponieważ czułość TOF‑MS w FS jest taka, jak w przypadku SIM dla kwadrupoli. Stąd też systemy TOF-MS dedykowane są do prowadzenia analiz niecelowanych (ang. non-target). Duża szybkość rejestrowania danych przez spektrometry typu TOF‑MS powoduje, że są one z powodzeniem stosowane jako detektory w układach sprzężonych z kompletną dwuwymiarową chromatografią gazową (GCxGC). System typu GCxGC-TOF‑MS o nazwie Pegasus 4D jest powszechnie stosowanym rozwiązaniem analitycznym w metabolomice, ponieważ zapewnia bardzo dobre rozdzielenie analitów w próbce o bogatej matrycy za pomocą GCxGC oraz doskonałej jakości widma masowe wszystkich substancji docierających do detektora, dzięki TOF-MS. Stosując aparaty typu GCxGC‑TOF‑MS do poszukiwania biomarkerów, na przykład w płynach ustrojowych, można rozdzielić i zidentyfikować ponad 4000 różnych substancji podczas jednej analizy chromatograficznej.
Chromatogram analizy próbki moczu pobranej od osoby zdrowej wykonany techniką GCxGC-TOFMS [5].
Ogromna różnorodność pod względem struktury i pochodzenia metabolitów znajdujących się w próbce płynu ustrojowego bardzo często wymaga stosowania jeszcze bardziej wyrafinowanych rozwiązań detekcyjnych. W tego typu badaniach doskonale sprawdzają się wysokorozdzielcze spektrometry mas czasu przelotu (ang. high resolution TOF, HRT), umożliwiające bardzo dokładny pomiar masy analitu, co znacznie ułatwia jego poprawną identyfikację. Wysoką rozdzielczość w przypadku spektrometrów czasu przelotu osiąga się poprzez wydłużenie toru przelotu jonów. LECO Corporation, uznany w świecie producent spektrometrów mas, zastosował rozwiązanie polegające na zastosowaniu wieloodbiciowego analizatora czasu przelotu (ang. multi-reflecting TOF), uzyskując rozdzielczość analizatora mas równą R=50 000. Jego unikalna konstrukcja umożliwiła wydłużenie toru przelotu jonów do 40 m, zachowując przy tym dużą szybkość akwizycji danych równą 200 widm/s i wysoką czułość oznaczeń. Jest to system Pegasus HRT, stanowiący połączenie GC z wysokorozdzielczym spektrometrem TOF‑MS, zapewniający szybką i efektywną identyfikację metabolitów.
Wynik a interpretacja
Uzyskanie wyników analiz w postaci widm to dopiero początek drogi do uzyskania odpowiedzi na postawione w badaniu zagadnienie biologiczne czy biochemiczne. Wyciągnięcie właściwych wniosków merytorycznych wymaga bowiem zastosowania zaawansowanych technik biostatystycznych i bioinformatycznych. W wielu wypadkach fachowa analiza i obróbka wyników może okazać się etapem krytycznym eksperymentu. Pomocne są komercyjnie dostępne systemy oprogramowania.
W przypadku próbek o bogatej matrycy bardzo często spotykamy się z koelucją analitów, jak również maskowaniem jednych substancji przez inne, występujące w próbce na wyższym poziomie stężeń. Stąd też niezbędnym narzędziem podczas obróbki danych stają się funkcje dekonwolucji i automatycznego wyszukiwania pików dostępne w oprogramowaniu LECO ChromaTOF.
Dekonwolucja jest matematycznym algorytmem, który pozwala na wyizolowanie pików analitycznych z szumów lub przykrywających je substancji przeszkadzających, jak również na rozdzielenie koelujących pików. Zaś funkcja automatycznego wyszukiwania pików umożliwia zlokalizowanie na chromatogramie analitu na podstawie widma masowego, a następnie identyfikację substancji. Połączenie obu tych funkcji pozwala na znaczne ułatwienie oraz skrócenie przetwarzania uzyskanych danych.
Ponadto ChromaTOF posiada funkcję wykonywania obliczeń statystycznych bez konieczności eksportowania danych do specjalistycznego programu. Przykładowo, do porównania ze sobą dwóch otrzymanych grup próbek stosuje się funkcję „Statistical Compare”, która pozwala przyporządkować próbki do odpowiednich grup na podstawie czasu retencji, wysokości i powierzchni piku. Funkcja ta pozwala określić substancje statystycznie istotne. Ponadto oprogramowanie pozwala na obliczenie parametru o nazwie „Fisher Ratio”, który wskazuje na niezaobserwowane wcześniej różnice chemiczne pośród stworzonych klas próbek o bogatej matrycy. LECO oferuje także bibliotekę metabolitów zawierającą ponad 1100 widm masowych 700 substancji.
Przykład ukazujący niezmienione widma masowe rejestrowane za pomocą TOF-MS i zniekształcenie widm dzięki rejestrowaniu ich za pomocą analizatorów skanujących.
Szacuje się, że rynek metabolomiki podwoi swoją obecną wartość w przeciągu najbliższych pięciu lat. Metabolomika jako dziedzina biomedycyny ma nieoceniony potencjał, który może zostać spożytkowany w wielu obszarach biologii i medycyny, przede wszystkim w odniesieniu do rozwijającej się prężenie idei medycyny spersonalizowanej, ale także chemii klinicznej, toksykologii czy w poszukiwaniu biomarkerów chorób. Chociaż zrozumienie procesów zachodzących w organizmach żywych na poziomie molekularnym jest ciągle jeszcze w powijakach, to nie ulega wątpliwości, że to dziedziny genomiki funkcjonalnej, odegrają główną rolę w rozwoju biologii systemowej.
opracowała Ewa Sankowska
KOMENTARZE