Na szczególną uwagę zasługują lakazy bakteryjne, ze względu na dobrze poznane metody genetyki molekularnej oraz unikatowe właściwości fizyko-chemiczne (np. wysoka termotolerancja). Opracowanie metod selekcji, modyfikacji i hodowli różnych szczepów bakterii pod kątem produkcji lakaz jest kluczowe, aby w pełni wykorzystać potencjał aplikacyjny omawianych enzymów.

Lakazy (EC. 1.10.3.2) to polifenolowe oksydazy, należące do dużej rodziny enzymów, określanej mianem „oksydazy wielomiedziowe” tzw. MCOs (ang. Multicopper Oxidases). Lakazy katalizują utlenianie różnych związków, głównie aromatycznych m.in. należących do fenoli i anilin, zawierających ugrupowania łatwo oddające. Proces ten odbywa się przy udziale tlenu atmosferycznego. Masa cząsteczkowa tej grupy enzymów mieści się w zakresie 50-97 kDa. Pod względem chemicznym, lakazy są glikoproteinami, u których część cukrowa może stanowić nawet 45% masy natywnej cząsteczki enzymu. Mechanizm reakcji katalizowanych przez lakazy, opiera się na tworzeniu produktu w wyniku utlenienia czterech cząsteczek substratu do rodników przy jednoczesnej redukcji cząsteczki tlenu do dwóch cząsteczek wody. Proces może przebiegać trzema drogami:

A) bezpośrednie utlenianie substratu;

B) utlenianie substratu z udziałem mediatora;

C) reakcje sprzęgania.

Dotąd opisano lakazy syntezowane przez organizmy należące do Archaea, Bacteria i Eukaryota, przy czym większość obecnie stosowanych na skalę przemysłową lakaz to enzymy grzybów należących do podstawczaków (Basidiomycota). Obecność tej grupy enzymów zidentyfikowano u roślin, owadów oraz mszaków. Stosunkowo niedawno, lakazy opisano także u organizmów prokariotycznych – bakterii. Dotąd najwięcej badań i opracowanych kierunków zastosowań wykonano dla lakaz grzybowych – głównie dla produkowanych przez grzyby tzw. białej zgnilizny drewna m.in. grzybów z rodzaju Trametes, Phanerochaete i Coriolus. Także bakteryjne enzymy mają duży potencjał aplikacyjny, pomimo że dotąd nie są powszechnie wykorzystywane na skalę przemysłową. Wysoki potencjał lakaz bakteryjnych wynika z właściwości fizyko-chemicznych np. termostabilności oraz bardzo dobrze opracowanych metod genetyki molekularnej dla Prokaryota.

Wśród licznych enzymów oksydoredukcyjnych, lakazy charakteryzują się unikatowymi cechami i posiadają różnorodne zastosowania praktyczne. Lakazy wykazują m.in. działanie pozakomórkowe, posiadają bardzo niską specyficzność substratową, a ich jedynym produktem ubocznym jest woda. Dzięki temu, stanowią grupę enzymów przyjaznych środowisku.

Immobilizacja (unieruchamianie) lakaz zwiększa trwałość powyższych enzymów (oporność na niekorzystne warunki środowiska) oraz ułatwia odzysk biokatalizatora (w celu powtórnego użycia preparatu). Metoda immobilizacji dobierana jest w zależności od rodzaju lakazy. Do wspomnianych metod należą np. adsorpcja, formowanie wiązań kowalencyjnych oraz tworzenie wiązań krzyżowych.

Włókiennictwo i garbarstwo

W przemyśle włókienniczym (na różnych etapach produkcji tkanin, w tym także podczas barwienia) stosowane są związki o bardzo zróżnicowanej budowie chemicznej. Lakazy używane są m.in. do utrwalania barwnych nadruków na tkaninach. Stanowiąc składnik roztworu płuczącego, lakazy mogą szybko utlenić nadmiar zastosowanego barwnika, który nie uległ związaniu przez włókna materiału. Barwniki syntetyzowane z udziałem lakazy stanowią alternatywę dla wykorzystywanych obecnie sztucznych barwników. Synteza z użyciem biokatalizatora przebiega w łagodnych warunkach w środowisku wodnym, nie wymaga użycia toksycznych substancji, a także obniża zużycie energii i wody. Barwne produkty otrzymane za pomocą lakaz to m.in. barwniki azowe, fenoksazynowe, fenolowe i niefenolowe. Co więcej, dzięki syntezie barwników metodą in situ możemy wzmocnić efekt barwiący oraz skrócić proces barwienia, a wytworzone produkty uboczne powstałe podczas reakcji są przyjazne środowisku. W garbarstwie powszechnie wykorzystywane są rozpuszczalne prekursory barwników. W wyniku różnych procesów np. utlenienia, polimeryzacji lub adsorpcji, nadają skórom ciemniejszą barwę. Lakazy stosowane są do tzw. oksydacyjnej transformacji prekursorów barwników, co z kolei umożliwia związanie się barwnych związków z kolagenem obecnym w wyprawionej skórze.

Przemysł papierniczy

Ligniny uważane są za potencjalne źródło związków aromatycznych – odnawialnego surowca dla przemysłu chemicznego. Trudna w rozkładzie lignina (występująca w ścianie komórkowej roślin), stanowi przeszkodę w produkcji celulozy, używanej podczas wytwarzania papieru. Powszechnie stosowane metody usuwające ligninę, wykorzystują szkodliwe związki będące źródłem zanieczyszczeń środowiska. Lakazy używane są głównie do rozkładu i odbarwiania związków z grupy chlorofenoli oraz chlorolignin. Związki te wchodzą w skład tzw. czarnego ługu i pulpy drzewnej, stanowiących odpad z zakładów celulozowych. Dodatkowo, pulpa drzewna i czarny ług zawierają charakteryzujące się niską podatnością na biodegradację barwniki roślinne. W ściekach generowanych podczas przetwarzania drewna obecne są również jony metali ciężkich i związki należące do wielopierścieniowych węglowodorów aromatycznych tzw. WWA. Dlatego czarny ług i pulpa drzewna zaliczane są do uciążliwych odpadów przemysłowych, trudnych do remediacji. W konwencjonalnych metodach delignifikacji i odbarwiania pulpy drzewnej wykorzystywane są chlorowe lub tlenowe utleniacze chemiczne. Jako metoda alternatywna wskazywane jest odbarwianie i degradacja pulpy drzewnej ze ścieków przy użyciu lakaz. Proces ten obejmuje m.in. bezpośrednie odchlorowanie, rozkład pierścieni aromatycznych i mineralizację. Dzięki powyższemu procesowi, lakazy poprawiają fizyko-chemiczne oraz mechaniczne właściwości pulpy drzewnej, poprzez wytwarzanie reaktywnych rodników, a także stabilizację grup funkcyjnych występujących we włóknach lignocelulozowych.

Produkcja żywności

Jedną z najważniejszych aplikacji lakaz w przemyśle spożywczym jest stabilizacja i poprawa smaku wina, poprzez ograniczenie zawartości związków fenolowych. Zastosowanie lakazy w procesie produkcji korków do butelek (Suberase®) redukuje cierpki smak powstający podczas długiego przechowywania wina. Lakazy odgrywają dużą rolę w przemyśle browarniczym. Użycie lakaz pozwala usunąć niepożądane związki tlenowe podczas warzenia piwa, co z kolei ogranicza mętnienie i zwiększa trwałość produktu. Głównym celem podczas klarowania soków owocowych i warzywnych jest obniżenie zawartości związków fenolowych oraz zmniejszenie cierpkości. Powszechnie używaną metodą tzw. stabilizacji soków jest ultrafiltracja. Dodatek immobilizowanej lakazy podczas powyższego procesu, zapobiega gromadzeniu się szkodliwych związków. Wyniki badań wskazują także, że lakaza unieruchomiona w hydrożelach może zastąpić proces ultrafiltracji. W piekarnictwie dodatek lakazy zwiększa wytrzymałość i objętość ciasta, a także zmniejsza jego lepkość. Ze względu na poprawę właściwości i struktury wypieków enzymy te mogą być także wykorzystywane do otrzymania produktów bezglutenowych. Immobilizowane lakazy są także stosowane jako biosensory w celu określenia zawartości oraz poprawy konsystencji jogurtów.

Przemysł kosmetyczny i farmaceutyczny

Przemysł kosmetyczny często wykorzystuje utleniający potencjał pestycydów występujących w owocach do produkcji preparatów przeznaczonych do higieny osobistej lub do farbowania włosów. Enzymy te mogą także wchodzić w skład dermokosmetyków służących do rozjaśniania skóry lub usuwania przebarwień. Najczęściej produkty tego typu zawierają chemiczne środki utleniające (np. nadtlenek wodoru), które mogą powodować uszkodzenia i podrażnienia skóry głowy. Lakazy, dzięki swoim utleniającym właściwościom, stanowią alternatywę dla związków takich jak H2O2, nie powodując przy tym zagrożenia dla kondycji skóry i włosów. Lakazy mogą być wykorzystywane w przemyśle farmaceutycznym do produkcji różnych leków m.in. środków przeciwdrobnoustrojowych (w tym antybiotyków) oraz leków przeciwnowotworowych. Różne aromatyczne podstawniki obecne w penicylinach i cefalosporynach półsyntetycznych mogą być substratami lakaz. Enzymy te, wykazują także zdolność ograniczania proliferacji niektórych typów komórek nowotworowych.

Ochrona środowiska

Enzymatyczna remediacja środowiska jest jednym ze sposobów przekształcania zanieczyszeń występujących w glebie oraz wodach w mniej szkodliwe związki. Lakazy są zdolne do utleniania różnorodnych ksenobiotyków (w tym pestycydów) obejmujących głównie związki z grupy fenoli np. chlorofenole oraz WWA. Usuwanie fenolowych zanieczyszczeń z gleby może odbywać się poprzez ich unieruchomienie za pomocą oksydacyjnego sprzęgania, katalizowanego przez lakazy. Użycie lakaz przyspiesza m.in. usuwanie fenoli i amin aromatycznych z wody. Mechanizm oczyszczania polega na enzymatycznym utlenianiu powyższych zanieczyszczeń do wolnych rodników albo chinonów, ulegających następnie polimeryzacji oraz częściowemu wytrąceniu.

W przeciwieństwie do szkodliwych dla środowiska syntetycznych związków utleniających, użycie lakaz może nieść za sobą pozytywne skutki, takie jak: oszczędność wody, energii i surowców, biokataliza jest także procesem ekologicznym. Liczne wyniki badań wskazują na możliwość stosowania lakaz bakteryjnych w procesach produkcji żywności, do syntezy środków farmaceutycznych oraz do utleniania zanieczyszczeń i usuwania odpadów. Z pewnością lakazy bakteryjne staną się w przyszłości często wykorzystywanymi enzymami w wielu gałęziach przemysłu, jednocześnie nie będąc kosztownymi i szkodliwymi dla środowiska. Obecnie otrzymywanie lakaz drobnoustrojowych (w tym bakteryjnych) jest procesem kosztownym. Dlatego konieczne są dalsze intensywne badania, aby udoskonalić proces syntezy i opracować efektywne metody produkcji w skali przemysłowej.

Dominika Kościółek