Biotechnologia.pl
łączymy wszystkie strony biobiznesu
Klonowanie, wektory – krótka powtórka przed sesją
Edyta Bańcyr, 22.01.2014 , Tagi: klonowanie, wektory, kosmid, BAC, YAC
Klonowanie, wektory – krótka powtórka przed sesją
Klonowanie DNA ma za zadanie wprowadzenie określonego, interesującego fragmentu przy wykorzystaniu autonomicznych wektorów. Tematyka związana z klonowaniem i pojęciami z nim pokrewnymi przewija się w branży bioscience. Poniżej, zestawienie najczęściej używanych wektorów oraz krótki schemat klonowania.

 

Podstawowe pojęcia- czyli jak nie pogubić się w fachowej terminologii

Wektor – to autonomicznie replikująca się cząsteczka DNA, która została skonstruowana sztucznie na bazie naturalnych plazmidów w celu przenoszenia  dodatkowej informacji genetycznej. Ogólnie rzecz biorąc wektory są pochodnymi naturalnie występujących plazmidów

Gen selekcyjny – wchodzi w skład wektora, służy odróżnianiu komórek gospodarza zawierających wektor od tych, które wektora nie zawierają . Gen selekcyjny nadaje komórkom oporność np.  na antybiotyki (penicylina, streptomycyna).

 

Przykłady wektorów

Do najczęściej wykorzystywanych w inżynierii genetycznej wektorów, zaliczane są plazmidy.  Plazmidy bakteryjne zawierają małe, koliste cząsteczki DNA, które wykazują zdolność do niezależnej od genomu gospodarza replikacji. Plazmidy zawierają specjalne miejsce zwane ORI (miejsce początku replikacji). ORI umożliwia niezależne namnażanie się w komórkach gospodarza. Co istotne, do podstawowych sekwencji wchodzących w skład wektora, wchodzą sekwencje kodujące oporność na antybiotyki.

 

Ryc.1 Plazmid z zaznaczonym promotorem, miejscem ORI i genami selekcyjnymi

 

Jednym z najczęściej stosowanych genów jest gen bla lub amp, kodujący beta-laktamazę. Ponadto, w plazmidach mogą być umieszczane miejsca zwane polilinkierami, czyli tzw miejscami „gęsto upakowanymi” sekwencjami rozpoznawanymi przez enzymy restrykcyjne.

 

Tabela 1. Podstawowe modyfikacje wektorów plazmidowych

PODSTAWOWE MODYFIKACJE WEKTORÓW PLAZMIDOWYCH

  • Redukcja masy cząsteczkowej (łatwiejsze manipulacje)
  • Usunięcie genów warunkujących możliwość transferu zrekombinowanego
  • Umieszczenie miejsc wielokrotnego klonowania MCS
  • Klonowanie tylko w miejscu MCS gwarantuje, że przy ekspresji klonowanego genu będzie zachowana ramka odczytu.
  •  Wprowadzenie silnego promotora przed miejscem MCS (wydajniejsza ekspresja)

 

 

 

Tabela 2. Cechy wektorów ekspresyjnych

PODSTAWOWE INFORMACJE DOT. WEKTORÓW EKSPRESYJNYCH

  • Wbudowany silny promotr, który podlega regulacji zewnętrznych (np. laktozowy, zmodyfikowany tryptofanowy, lambdowy prawy i lewy) podlegający regulacji zewnętrznej, służący do
  • Często mają wbudowane terminatory transkrypcji lub sygnały translacyjne
  • Do najistotniejszych wektorów ekspresyjnych zalicza się wektory z promotorem faga T7

 

 

Użyteczne wektory

Fag lambda jest powszechnie stosowanym wektorem większych fragmentów DNA. Cząsteczki faga lambda zdolne są do wstrzyknięcia liniowego DNA, do komórki gospodarza, gdzie następnie, materiał genetyczny przyjmuje formę kolistą. DNA faga lambda może ulegać dwóm rodzajom przekształceń- może ulegać replikacji, tworząc nowe cząsteczki, uwalniane na drodze lizy komórki (tzw. Cykl lityczny). Druga z dróg przekształceń to tzw. Cykl lizogenny, gdzie dzięki rekombinacji, materiał genetyczny faga ulega ingerencji z genomem gospodarza. Genom faga lambda ma ok 48,5 kPz. Na końcach występują tzw sekwencje cos, stanowiące tzw. Końce kohezyjne, które umożliwiają powstawanie formy kolistej. Na podstawie sekwencji wektora lambda opracowano wektory wymienne, jak EMBL3

 

M13 – używanie faga M13 stosowane jest w przypadku, gdy zależy nam na otrzymaniu fragmentu DNA w formie jednoniciowej. Fag M13 zawiera kolisty DNA, o długości ok 6,7 kpz. Po infekcji, do pojedynczej nici dosyntetyzowywana jest nić komplementarna, przez co fagowy DNA powiela się jako kolisty DNA.

 

Kosmidy – używane są do klonowania dużych fragmentów DNA (30-45 kpz). W kosmidach wykorzystywana jest sekwencja faga lambda.Duże fragmenty DNA, które poddawane są klonowaniu łączą się z sekwencjami cos faga lambda, przez co powstaje forma kolista. Dzięki temu, wektor ten namnaża się jak zwykły plamzid. Nazwa kosmid wywodzi się od sekwencji cos, które wchodzą w skład wektora.. Są one szczególnie przydatne do badania wielu genów eukariotycznych, zawierających liczne, długie introny, oraz innych sekwencji genomowego DNA.

 

Ryc.2 Kosmid z zaznaczonymi, charakterystycznymi sekwencjami cos

YAC sztuczny chromosom drożdżowy. Początkowo używane do badania procesów produkcji chromosomów, obecnie stosowane do klonowania bardzo dużych fragmentów DNA. Budowa oparta na wykorzystaniu tradycyjnego plazmidu z dołączonymi sekwencjami centromeru, telomeru i ORI.

 

Wektor BAC – sztuczny chromosom bakteryjny,  służą do klonowania insertów 300-500 kpz. Skonstruowane na bazie episomu F z E.coli, zawierają również sekwencje genów markerowych

 

Wektory eukariotyczne

Wektor czółenkowy – wektor, w których znajdują się sekwencje potrzebne do replikacji w E.coli, jak i w komórce docelowej gospodarza – ssaka.

2µ  zaliczany do episomalnych plazmidowych wektorów drożdżowych. Replikują jak plazmidy, przy czym jednocześnie mają zdolność do integrowania z chromosomowym DNA Bakulowirus – wirusy owadzie, używane do nadekspresji białek w komórkach ssaków. Głównym białkiem wytwarzanym przez wirusa jest poliedryna- białko z bardzo aktywnym promotorem.  Stosowane do produkcji białek na dużą skalę, w komórkach owadzich możliwe jest przeprowadzanie potranslacyjnych modyfikacji białek.

 

 

Jak klonować? Schemat procesu klonowania DNA

Uproszczony schemat klonowania oparty jest na czterech podstawowych etapach: fragmentacji, ligacji, transfekcji oraz selekcji.

a). Fragmentacja polega na wycięciu interesującego fragmentu DNA przy użyciu odpowiednio dobranych enzymów restrykcyjnych. 

b). Ligacja- jest to proces właczenia wyciętego fragmentu, do wektora. Co istotne, wektor musi być potraktowany tymi samymi enzymami restrykcyjnymi, w celu zapewnienia komplementarnych końców, które następnie ulegają łączeniu pod wpływem ligazy

c). Transfekcja- czyli pobranie zmienionych wektorów, przez kompetentne komórki-biorców (np. bakterie).

d). Selekcja- komórek, do których wbudwał się interesujący fragment możliwa jest, dzięki wykorzystaniu genów oporności na antybiotyki. Np., bakterie które nie pobrały plazmidu niosącego dany fragment DNA i genu oporności na Ampicylinę, nie wyrosną na podłuży zwierającym ten antybiotyk. 

 

Ryc.3 Uproszczony schemat klonowania

KOMENTARZE
news

<Listopad 2019>

pnwtśrczptsbnd
28
30
31
1
2
3
4
7
MEDmeetsTECH
2019-11-07 do 2019-11-07
9
40. Kongres i Targi LNE
2019-11-09 do 2019-11-10
10
11
15
16
17
22
23
24
27
28
Warsaw FOODHATON 2019
2019-11-28 do 2019-11-28
29
30
1
Newsletter