Biotechnologia.pl
łączymy wszystkie strony biobiznesu
Jeden nukleotyd, dwa barwniki
07.04.2010
Badacze zademonstrowali możliwości sond zbudowanych z wyznakowanych fluorescencyjnie oligonukleotydów, które nazwali excition primers. Zastosowanie dla tych sond to reakcje genotypowania SmartAmp2
Obecnie dostępnych jest kilka fluorescencyjnych znaczników do monitorowania reakcji PCR w czasie rzeczywistym. Barwnik SYBR Green I może być użyty do identyfikacji postępu reakcji poprzez interkalowanie (wnikanie) pomiędzy dwie nici DNA. Choć szeroko stosowany, łączy sie z pewnymi niedogodnościami: stężenie barwnika musi być ściśle kontrolowane by ograniczyć fałszywe sygnały tła, fałszywie pozytywne sygnały mogą pochodzić od primerów w których cząsteczki wnika barwnik, lub od ubocznych produktów reakcji PCR. Ponadto sygnał pochodzący z barwnika nie jest swoisty względem sekwencji. Drugi rodzaj barwników, sondy hybrydyzacyjne TaqMan umozliwają detecję swoistą względem sekwencji, ale ogólnie rzecz biorąc nie mogą być używane w amplifikacjach izotermiczych, bo wymagają reakcji związanej z aktywnością eegzonukleazy (degradacja sondy, uwolnienie fluorochromu).

Pisząc dla czasopisma Human Mutations, Lazhava i wsp. pokazali możliwości wybarwionych fluorescencyjnie sond oligonukleotydowych które nazwali exciton primers (reakcja SmartAmp - Smart Amplification Process). Sondy te wykorzystują zjawisko inkorporacji pojedynczego nukleotydu niosącego ze sobą dwa barwniki fluorescencyjne, które ulegają wyciszeniu gdy związane są z jednoniciową cząsteczką DNA. Gdy ulęgają hybrydyzacji (czyli połączeniu z drugą, w tym przypadku komplementarną, nicią DNA dochodzi do zaburzenia połączenia pomiędzy dwoma barwnikami, a uwolnione cząsteczki emitują stabilną fluorescencję. Co ciekawe, sygnał jest tak silny, że może być (w obecności światła nadfioletowego UV) wykryty gołym okiem. Sygnał pozostaje aktywny tak długo, jak odcinki DNA są ze sobą połączone. Ze względu na fakt, że obydwa barwniki są połączone z pojedynczym nukleotydem w obrębie primera, fluorescencja ulega supresji nawet kiedy w środowisku reakcji obecna jest nukleaza. Ta z kolei cecha pozwala primerom exciton być używanym w nieoczyszczonych próbkach. Reakcja SmartAmp2 jest optymalizowana do genotypiowania próbek krwi. Reakcja opiera się na zastosowaniu asymetrycznych primerów, czego wynikiem jest powstanie jednoniciowych produktów złożonych względem samych siebie tak w końcu 3' jak i 5'. Te złożenia tworzą nowe miejsca rozpoczęcia reakcji i promują samopowielanie (self-amplification). Reakcja może być przyspieszona poprzez dodatek trzeciego primera, który hybrydyzuje z sekwencjami wypętlonymi.

Autorzy wykazali w swojej pracy, że primery exciton mogą pełnić rolę wszystkich trzech primerów w reakcji SmartAmp2, w tym aplifikacji małych ilości matrycy (wystarczy 6 kopii). Czyłość tej metody porównywalan jest z osiąganą w przypadku SYBR Green I.

Lezhava et al. 2010. Exciton primermediated SNP detection in SmartAmp2 reactions. Hum. Mut. 31:208-217.
KOMENTARZE
Newsletter