Biotechnologia.pl
łączymy wszystkie strony biobiznesu
Jak stworzyć enzymy doskonałe?
Jak stworzyć enzymy doskonałe?
Dynamiczny rozwój branży life science zwiększa zapotrzebowanie na nowe enzymy o lepszej wydajności, możliwe do stosowania w mediach niekonwencjonalnych. Ewolucja postępuje zbyt wolno by temu sprostać. Na ratunek przychodzi racjonalna inżynieria białek, która pozwala tworzyć mutanty białek o pożądanych cechach.

Inżynieria białek polega na zastosowaniu czynników chemicznych lub genetycznych technik modyfikacji  do zmian w sekwencji aminokwasowej. Powstają w ten sposób mutanty białkowe, które uzyskują nową aktywność czy specyficzność. Metody biologii molekularnej są najbardziej zadowalającymi narzędziami do ingerencji w strukturę białkową. Wykorzystuje się w tym celu  ukierunkowaną ewolucję oraz racjonalne projektowanie. Pierwsza metoda jest mało wydajna. Wykorzystuje ona losową mutagenezę, która polega na tworzeniu przypadkowych mutacji. Jest to możliwe dzięki stosowaniu metody błędnego PCR czy tasowania DNA. Nieplanowane zmiany łańcucha aminokwasowego przynoszą trudne do przewidzenia efekty, co obniża wydajność  tej metody. Następnie przeprowadza się screening mutantów. Polega on na stosowaniu specjalnych podłóż zawierających substrat, który powinien być katalizowany przez udoskonalony enzym.  Jednak zbyt duża losowość prowadzi do tworzenia  ogromnej biblioteki mutantów. Metoda ta wiąże się z nikłym prawdopodobieństwem  wytworzenia katalizatora, akurat z tą cechą, która jest potrzebna. Mimo tego, korzystanie tej drogi doskonalenia enzymów jest dużo prostsze niż racjonalnej inżynierii białek, dlatego dość powoli się od niej odchodzi.

 

Racjonalna inżynieria białek wymaga przede wszystkim znajomości struktury 3D danego białka. Dzięki temu praca ograniczona jest tylko do dobrze poznanych enzymów. Możliwe jest to dzięki takim narzędziom jak krystalografia rentgenowska czy spektroskopia magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR). Ważna jest także wiedza na temat modyfikacji sekwencji aminokwasowej takich jak podstawienie, wstawienie i usunięcie. Pierwszym etapem racjonalnej inżynierii białek jest analiza struktury białka. Najczęstszym celem mutacji są zmiany w obrębie centrum aktywnego, ponieważ to ono ma największy wpływ na aktywność enzymu. Mutacje planuje się z pomocą technik modelowania komputerowego. Narzędzia bioinformatyczne takie jak VMD, PyMol, Swiss PDB Viewer, umożliwiają wizualizację struktur białkowych, miejsc dokowania ligandów, a nawet potrafią przewidzieć jak zachowa się białko po wprowadzeniu konkretnej mutacji. Podczas modelowania komputerowego do wizualnego przedstawienia enzymu oraz zaplanowania miejsca mutacji wykorzystuje się sekwencje aminokwasowe zamieszczone w internetowych bazach danych. Kolejny etap racjonalnej inżynierii białek to już ukierunkowana mutageneza, która polega na wprowadzeniu mutacji w sekwencji genu kodującego enzym w zaplanowanym wcześniej miejscu. Jest to możliwe dzięki zastosowaniu metod wykorzystujących startery, takich jak: OVERLAP oraz QUIKChange.

OVERLAP polega na wprowadzaniu dwóch primerów z określoną mutacją, które są wbudowywane  w sekwencje genu w 3 różnych reakcjach PCR.

Rys.1. Schemat techniki OVERLAP wykorzystująca 3 reakcje PCR.

 

Metoda QUIKChange działa ona na podobnej zasadzie, z tym że tylko starter z mutacją jest komplementarny do plazmidowego DNA.

 

Rys. 2. Schemat metody QUIKChange

 

Można zastosować także mutagenezę kasetową, gdzie restryktazy wycinają całą sekwencję zasad, a następnie wprowadza się  jej syntetyczny odpowiednik z mutacją. Racjonalna inżynieria białka kończy się transformacją nowej sekwencji białka do E. coli, a następnie wydzieleniem i oczyszczeniem białka.

 

Inżynieria białek jest niezbędnym narzędziem do pokonania ograniczeń naturalnych enzymów. Stosowanie mediów niekonwencjonalne jak np. płyny jonowe czy rozpuszczalniki organiczne, wymusza od naukowców ciągłą prace nad adaptacja białek do nowych warunków reakcji. Jest to szansa na pełniejsze wykorzystanie różnych środowisk reakcyjnych. Nawet tych, które do tej pory uważane były za odpady.

KOMENTARZE
Newsletter