Biotechnologia.pl
łączymy wszystkie strony biobiznesu
Deoksyrybozymy – katalityczne DNA
Deoksyrybozymy – katalityczne DNA
W 1994 roku prof. Ronald R. Breaker po raz pierwszy pokazał, że rola DNA nie ogranicza się do funkcji nośnika informacji genetycznej. Enzymy DNA (deoksyrybozymy) zdolne są do katalizowania różnorodnych reakcji chemicznych i znajdują szereg zastosowań w biologii molekularnej, diagnostyce, nanotechnologii i medycynie.

Deoksyrybozymy to jednoniciowe fragmenty DNA o długości około kilkudziesięciu nukleotydów, mające zdolność katalizowania reakcji chemicznych. W większości substratami dla DNA enzymów są kwasy nukleinowe, gdzie mamy do czynienia z reakcjami cięcia (poprzez hydrolizę bądź transestryfikację) lub ligacji. Nie wyczerpuje to jednak wszystkich możliwości. Zanane są deoksyrybozymy mające zdolność modyfikacji aminokwasów, wykazując aktywność fosfatazy oraz kinazy, jak również takie, które sprzyjają reakcji tworzenia wiązania pomiędzy dwoma atomami węgla (reakcja Dielsa-Aldera). Ciekawym przykładem katalitycznych możliwości DNA jest zdolność użycia światła do naprawy (rozbicia) dimerów pirymidynowych, powstających na skutek ekspozycji na promieniowanie UV. W przeciwieństwie do fotoliaz, analogicznych enzymów białkowych, enzymy DNA nie wykorzystują dinukleotydu flawinoadeninowego (FADH) jako kofaktora. Ponadto niektóre deoksyrybozymy wykazują zdolności autokatalityczne, czego przykładem może być reakcja autofosforylacji, autoadenylacji z wytworzeniem wiązania 5’,5’-trifosforanowego (struktura analogiczna do czapeczki w mRNA) oraz autodepurynacji.

 

Przykłady reakcji katalizowanych przez deoksyrybozymy.

 

Budowa deoksyrybozymów

DNAzymy zbudowane są z dwóch części – ramion wiążących oraz pętli katalitycznej. Ramiona mają długość około 10-20 nukleotydów i są komplementarne do określonego substratu, co warunkuje specyficzność tych enzymów. Pętla katalityczna to fragment o długości około 30-40 nukleotydów, który jest odpowiedzialny za przeprowadzenie określonej reakcji chemicznej. Sekwencja pętli katalitycznej danego enzymu jest unikalna, podobnie jak sekwencja każdego białka. Ramiona możemy zaprojektować w dowolny sposób, w zależności od tego jaka cząsteczka ma być substratem. Mechanizm działania deoksyrybozymów nie został jeszcze poznany. Wiadomo, że warunkiem efektywnej katalizy jest przybranie przez pętlę katalityczną odpowiedniej – aktywnej konformacji, oraz, że enzymy DNA w większości używają jonów metali jako kofaktorów. Jak dotąd nikomu nie udało się jednak skrystalizować i rozwiązać struktury żadnego z deoksyrybozymów, chociaż wiele grup badawczych prowadzi prace zmierzające w tym kierunku.

Schemat katalitycznej cząsteczki DNA.

 

Zastosowania

Spektrum zastosowań deoksyrybozymów jest bardzo szerokie, począwszy od biologii molekularnej i nanotechnologii,  skończywszy na medycynie. W laboratorium enzymy DNA stanowią przede wszystkim alternatywę dla białek, w szczególności w przypadkach kiedy niemożliwa jest kataliza z użyciem enzymu proteinowego. Przykładem może być ligacja dwóch fragmentów RNA zawierających modyfikacje w postaci wolnych rodników (znaczników spinowych), niezbędnych do badań strukturalnych z zastosowaniem spektroskopii EPR (spektroskopia elektronowego rezonansu paramagnetycznego). Połączenie tych cząsteczek przy pomocy ligazy faga T4 wymaga użycia DTT (ditiotreitolu), który redukuje znaczniki spinowe, powodując ich dezaktywację. Problem ten z powodzeniem można rozwiązać zastępując enzym białkowy enzymem DNA. Ponadto przewagą enzymów DNA nad białkami jest ich cena (są nieporównywalnie tańsze od enzymów proteinowych), oraz fakt, że nie ulegają nieodwracalnej denaturacji. Po skończonej reakcji można je zatem wyizolować i użyć ponownie.

Kolejną gałęzią zastosowań deoksyrybozymów jest diagnostyka. Inżynieria enzymów DNA sprawiła, że mogą być one z powodzeniem stosowane jako elementy sensorów. Największą grupę czujników opartych o enzymy DNA stanowią w chwili obecnej te, które używane są do detekcji jonów metali. Ciekawym przykładem jest sensor wykrywający niebezpieczne jony uranu. Składa się on z katalitycznej cząsteczki DNA (deoksyrybozymu) oraz substratu  związanego z wygaszonym fluoroforem. Obecność uranylu ([UO2]2+) powoduje katalityczne rozcięcie fragmentu DNA, uwolnienie fluoroforu i co za tym idzie wzrost mierzonej wartości fluorescencji. Sensor wykrywa jony uranu w stężeniach od 45 pM do 400 nM oraz jest wysoce selektywny. Jego czułość względem jonów uranu jest ponad milion razy wyższa niż wobec jonów innych metali. Przy zastosowaniu podobnej strategii został też zaprojektowany sensor do detekcji jonów ołowiu i miedzi. Innymi znanymi konstrukcjami działającymi w oparciu o enzymy DNA są czujniki do detekcji jonów rtęci, srebra, potasu oraz cząsteczek GTP.

Sensor wykorzystujący katalityczne DNA do detekcji jonów uranu. [DOI: 10.1073_pnas.0607875104]

Intensywne badania prowadzone są w kierunku optymalizacji działania deoksyrybozymów w żywych komórkach, zarówno bakteryjnych jak i eukariotycznych. DNAzymy mają potencjał do powiększenia grupy narzędzi służących do modyfikacji lub degradacji konkretnego DNA lub RNA związanego np. z niepożądanym genem. Wiadomo również, że katalityczne DNA może być użyte do wizualizacji bakteryjnego RNA (16S rRNA), z limitem detekcji na poziomie 12,5 ng. Co więcej, można w ten sposób odróżnić bakterie chorobotwórcze od spokrewnionych bakterii niepatogenicznych. Wspomniana sonda zbudowana jest z dwóch deoksyrybozymów, z czego jeden wykazuje aktywność peroksydazy. Po rozpoznaniu odpowiedniej sekwencji bakteryjnego RNA aktywność oksydacyjna zostaje uruchomiona, w wyniku czego następuje utlenienie bezbarwnej reporterowej cząsteczki organicznej do formy w której wykazuje ona barwę niebieskozieloną. Jeżeli próbki roztworu naniesione zostaną na płytkę TLC, zmiany stężenia bakteryjnego RNA  mogą zostać rozpoznane nawet gołym okiem.

 

Czy katalityczne DNA występuje w naturze?

Wszystkie wyizolowane do tej pory deoksyrybozymy zostały stworzone sztucznie, w laboratorium, przy użyciu techniki zwanej in vitro selekcją (SELEX). Czy jest szansa, że tego typu cząsteczki występują również w naturze? Jak dotąd brak jednoznacznych dowodów na potwierdzenie lub zaprzeczenie tej hipotezy a sami naukowcy mają odmiennie opinie na ten temat. Z jednej strony, pomimo, że znamy sekwencje genomów wielu organizmów, nie znamy wszystkich funkcji pełnionych przez ich kwas deoksyrybonukleinowy. Istnieje zatem szansa, że wśród niekodujących odcinków DNA znajduje się miejsce dla deoksyrybozymów. Z drugiej strony wiadomo, że DNA w komórce prawie zawsze występuje w formie podwójnej helisy, a przecież deoksyrybozymy tworzą swoje pętle katalityczne z DNA jednoniciowego. Ciekawym głosem w dyskusji jest artykuł opublikowany w zeszłym roku przez Ronalda Breakera. Donosi, że zidentyfikowane zostały dwie nowe klasy deoksyrybozymów zdolne do autohydrolizy (cięcia) w obecności cynku (Zn2+) i przy neutralnym pH. Kiedy porównano sekwencje wyizolowanych DNAzymów z naturalnymi sekwencjami DNA zdeponowanymi w bazie danych RefSeq i Global Ocean Survey, okazało się, że enzymy wyizolowane sztucznie w laboratorium mają swoje odpowiedniki (analogiczne sekwencje) w naturze. Następnie, na podstawie przeprowadzonych eksperymentów, udowodniono, że część ze wspomnianych naturalnie występujących sekwencji DNA również wykazuje właściwości autokatalityczne w obecności jonów cynku. Prowadzi to do destabilizacji określonych fragmentów genomu. Jednak na pytanie czy taki rodzaj aktywność jest rzeczywiście wykorzystany w żywych organizmach mogą odpowiedzieć wyłącznie przyszłe badania.

Źródła

Źródła:

  1. S.K. Silverman, Catalytic DNA (deoxyribozymes) for synthetic applications – current abilities and future prospects, Chem. Commun. 2008
  2. W. Pan and G. A. Clawson, Catalytic DNAzymes: derivations and functions, Expert Opin. Biol. Ther. 2008
  3. D. J.-F. Chinnapen and D. Sen, A deoxyribozyme that harnesses light to repair thymine dimers in DNA, PNAS 2004
  4. J. Chandrasekar and S. K. Silverman, Catalytic DNA with phosphatase activity, PNAS 2013
  5. S. M. Walsh, A. Sachdeva and S. K. Silverman, DNA Catalysts with Tyrosine Kinase Activity, JACS 2013
  6. J. Liu et al., A catalytic beacon sensor for uranium with parts-per-trillion sensivity and millionfold selectivity, PNAS 2007
  7. W. Li et al., Detection of lead(II) ions with a DNAzyme and isotherman strand displacement signal amplification, Biosensors and Bioelectronics 2014
  8. S.A. McManus and Y. Li, Turning a Kinase Deoxyribozyme into a Sensor, JACS 2013
  9. D.-L. Ma et al., Oligonucleotide-Based Luminescent Detection of Metal Ions, Chem. Asian J. 2011
  10. Y.V. Gerasimova et al., Deoxyribozyme Cascade for Visual Detection of Bacterial RNA, ChemBioChem 2013
  11. H. Gu et al., Small, highly Active DNAs that hydrolize DNA, PNAS 2013
KOMENTARZE
Newsletter