Dlaczego in vitro?

Obserwacja komórek nerwowych żaby przez R. G. Harrison'a była podstawą do powstania idei o hodowli komórek i ich badania poza organizmami żywymi.  Jednak pierwsze próbne hodowle szybko ulegały zakażeniu, co prowadziło do obumarcia komórek i całej hodowli. Wprowadzenie przez amerykańskiego chirurga A. Carrela procedur pobierania i hodowli komórek w warunkach sterylnych pozwoliło na znaczne wydłużenie żywotności hodowanego materiału. Początkowo brakowało ustandaryzowanej metodologii postępowania i tego typu prace były czymś w rodzaju ciekawostki naukowej. Jednak kolejne badania zmusiły do wprowadzenia protokołów postępowania w celu otrzymania linii komórkowych do namnażania i testowania wirusów. Dało to początek współczesnym technologiom hodowli tkanek, analizom biochemicznym na materiale żywym oraz biotechnologicznemu wykorzystaniu w celu produkcji substancji sekrecyjnych oraz biologicznie aktywnych. W rezultacie doprowadziło to do innowacyjnych badań na komórkach macierzystych, produkcji przeciwciał monoklonalnych i wykorzystania technologii na skalę przemysłową, a obecnie nawet do hodowli całych organów.

W historii hodowli komórkowych i tkankowych dominują badacze i ich osiągnięcia uzyskane na komórkach ssaków. Obecnie coraz większym zainteresowaniem cieszą się hodowle komórek owadzich, ryb, ptaków, płazów i gadów. Mają one głównie znaczenie przy ocenie toksycznego wpływu pestycydów, środków ochrony roślin, a także zanieczyszczeń biosfery.

Dzięki hodowlom tkankowym in vitro możliwe było poznanie mechanizmów produkcji przeciwciał, działania hormonów, enzymów. Dodatkowo stał się możliwy rozwój immunocytochemii oraz produkcja białek ulegających modyfikacjom potranslacyjnym, których prowadzenie nie jest możliwe w innych typach komórek.

"Niewątpliwie należy dodać, że wykorzystanie linii komórek nowotworowych w rutynowych badaniach cytotoksyczności związków chemicznych stwarza bardzo sprawne narzędzie skriningowe w poszukiwaniu nowych substancji użytecznych w onkologii. Na całym świecie tysiące naukowców, każdego dnia analizuje dziesiątki tysięcy próbek, a wyniki uzyskują w ciągu zaledwie kilku dni. Gdyby nie popularność hodowli tkankowych takie prace byłyby niemożliwe do realizacji na tak dużą skalę" - dodał mgr Dawid Stefaniuk z Uniwersytetu Marii Curie-Skłodowskiej w Lublinie.

Podstawowe wyposażenie

Popularność i łatwość prowadzenia hodowli komórkowych może się wydawać pozorna kiedy zaczniemy analizować mnogość różnorodnego, specjalistycznego sprzętu niezbędnego do realizacji tego typu badań.

Dwa podstawowe elementy to komora laminarna zapewniająca pracę w jałowych warunkach oraz inkubator pozwalający na utrzymanie odpowiednich, stałych warunków, zarówno temperatury, jak i gazów. Oprócz tego niezbędny jest cały szereg urządzeń jak mikroskop świetlny odwrócony (głównie do obserwacji hodowli i oceny gęstości komórek), lodówki do przechowywania składników podłóż hodowlanych i roztworów, zamrażarki zarówno -20 C jak i -80 C, a także naczynie Dewara z ciekłym azotem do przechowywania czystych linii komórkowych. Dodatkowo niezbędna jest bardzo duża ilość drobnego sprzętu laborytoryjnego (wirówki, mieszadła magnetyczne), plastikowych narzędzi oraz autoklaw do przygotowywania jałowych materiałów i unieszkodliwiania materiału biologicznego. Jednym z bardzo ważnych elementów wyposażenia laboratoriów do hodowli in vitro jest system do oczyszczania wody. Hodowle wymagają bardzo czystej wody oraz wielu odczynników do sporządzania podłóż hodowlanych i płynów podtrzymujących. Więcej na ten temat dostępne jest tutaj.

Klasyfikacja hodowli tkanek

Należy pamiętać, że wyróżniamy 5 podstawowych klas hodowli. Krótka charakterystyka poniżej:

1.    Hodowle pierwotne - jak sama nazwa wskazuje, są to wszystkie hodowle założone z materiału biologicznego bezpośrednio pobranego z organizmu. Zarówno z fragmentu tkanki jak i zawiesiny powstałej w wyniku enzymatycznej dezintegracji tkanki. Hodowla jest nazywania jako pierwotna  do pierwszego pasażu. Po nim nazywa się je hodowlą wtórną.

2.    Hodowle w zawiesinie

Znaczna część hodowli komórkowych  do wzrostu i proliferacji wymaga adhezji do powierzchni. Jednak linie komórek krwi oraz nowotworowych mogą proliferować w zawiesinie. Tego typu hodowle prowadzone są w naczyniach z wbudowanym mieszadłem magnetycznym, zapewnia ono ciągły ruch cieczy oraz uniemożliwia sedymentację komórek. 

3.    Hodowle narządowe

 Zachowanie odpowiednich warunków umożliwia hodowlę w warunkach in vitro całych narządów lub ich fragmentów bez zaburzania zróżnicowania tkanek. Przy tego typu hodowli konieczne jest zachowanie krytycznej wielkości fragmentu narządu, zapewnienie odpowiedniego obiegu gazów, metabolitów i substancji odżywczych.

4.    Hodowle na mikronośnikach

Pozwalają na znaczne zwiększenie powierzchni adhezyjnej dla komórek. Wykorzystuje się je głównie w celu namnożenia dużej biomasy w małej objętości pożywki oraz do wydajnej produkcje metabolitów w bioreaktorach. Tego typu hodowle są niezwykle użyteczne w przemyśle biotechnologicznym. Do zwiększenia powierzchni adhezyjnej wykorzystuje się kulki dekstranowe, żelatynowe, szklane oraz wykonane z materiałów syntetycznych np. plastiku.

5.    Hodowle przestrzenne

Hodowle zapewniające komórkom/ tkankom wzrost w trójwymiarze. Wykorzystuje się je na potrzeby badań macierzy zewnątrzkomórkowej. Prowadzenie tego typu hodowli jest jak na razie największym osiągnięciem ludzkości w tej dziedzinie. Dzięki temu możliwe jest prowadzenie hodowli całych narządów, ich fragmentów, a także kokultur organotypowych. Służą jako narzędzie modelowe na potrzeby wielu eksperymentów, w tym także na potrzeby transplantologii.

W warunkach przemysłowych produkcja białek, które do osiągnięcia swojej farmakologicznej aktywności wymagają przeprowadzenia modyfikacji potranslacyjnych jak np. glikozylacja, możliwa jest tylko przy użyciu hodowli tkankowych. Przykładem pozyskiwanych w ten sposób białek są niektóre czynniki krzepliwości krwi, tkankowy aktywator plazminogenu, interferony oraz cytokiny.